3、蛋白质的性质实验(二)

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1、三、蛋白质的性质实验（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一.蛋白质等电点的测定1、目的1）.了解蛋白质的两性解离性质。2）.学习测定蛋白质等点电的一种方法。2、原理蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列平衡：ax)KNH3pH>p!pH-plemufrNH>pH

2、是测其溶解度最低时的溶液pH值。本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配置成各种不同pH值的缓冲液。向各缓冲溶液加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。3、器材水浴锅、温度计、200ml的锥形瓶、100ml的容量瓶、乳体、试管、试管架及吸管4、试剂1）、0.4%酪蛋白：总量200ml（每组配100ml）称取0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200ml锥形瓶内，用少量4（）〜50°C的温水洗涤乳钵，将洗涤液液移入锥形瓶内。加入10mllmol

3、/LSB酸钠溶液。把锥形瓶放到50°C水浴中，并小心的旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移至100ml容量瓶内，加水至刻度，塞紧瓶塞，混匀。2）、1.00mol/L醋酸溶液:每组配100ml3）、0.10mol/L醋酸溶液：每组配200ml4）、0.01mol/LE5酸溶液：每组配50ml5、操作1）、取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地加入各试剂，然后混匀。试管号蒸馆水（ml）0.01mol/ml醋酸(ml)0.1mol/ml醋酸(ml)1.0mol/ml醋酸(ml)1&40.62&70.338.01.047.41.62）、

4、向以上试管中加含酪蛋白的醋酸钠溶液lml,加一管，摇一管。此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.3、4.7、3.50观察其混浊度。静置10分钟，再观察其混浊度。最混浊的一管的pll即为酪蛋白的电点。二、蛋白质的沉淀及变性1、目的1）.加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。2）.了解沉淀蛋白质的儿种方法及其实用意义。3）.了解蛋白质变性与沉淀的关系。2、原理原理：在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。（1）可逆的沉淀反应此时蛋白质

5、分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂屮，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此反应。（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂屮。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质液未必都变性。3、试剂配制1）5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶

6、液（新鲜鸡蛋清：水二1：9）总量500ml取100ml新鲜的鸡蛋清，加900ml水，搅拌均匀，澄清取上清液。2）PH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲液：总量100ml3）3%硝酸银溶液：总量10ml4）5%三氯乙酸：每组配50ml5）95%乙醇：总量250ml6）硫酸钱结晶粉末：7）饱和硫酸鞍溶液：每组配250ml8）OJmol/LHCl:总量300ml9）ol/LNaOH：总量100ml10）0.05mol/LNa2C03溶液：每组配100ml11）0.lmol/1醋酸溶液100ml12）甲基红溶液：总量200ml（每组配50ml）称取0.02g甲基红，溶于3

7、.72ml0.02mol/LNaOH溶液中，用水稀释至50ml013）2%氯化钦溶液4、操作（1）蛋白质的盐析无机盐（硫酸钱、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同,析出的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸鞍溶液屮析出，而清蛋白则在饱和硫酸鞍溶液屮才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。加5%卵清蛋口溶液5ml于试管中，再加等量的饱和硫酸钱溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？将管内内容物过滤，向滤液中添加硫酸鞍粉末到不再溶解为止

8、，此时析出的沉淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸憎水，观察沉淀的再溶解。（2）