大肠杆菌中胞外分泌n糖蛋白地生产

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1、实用标准文案大肠杆菌中胞外分泌N糖蛋白的生产AdamC.Fisher,1CharlesH.Haitjema,2‡CassandraGuarino,3,4‡EdaC¸elik,3‡ChristineE.Endicott,3‡CraigA.Reading,1JudithH.Merritt,1A.CelestePtak,5ShengZhang,5andMatthewP.DeLisa2,3,4*摘要空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）的pgl基因组编码的一个完整的N蛋白糖基化的途径，这个途径能官能地移到大肠杆菌上去。在这个系统中，我们分析N糖基化，细菌中膜迁移和受体蛋白折叠之间的

2、相互作用。我们开发了一个重组N–聚糖受体肽标签，允许不同的重组蛋白的N-糖基化，蛋白质在能糖基化大肠杆菌分子的周质中表达。用这种糖基化标签，一个明显不同之处在糖基化模型中被观察到了，周质蛋白决定了内膜迁移的模型（i.e.,Sec，信号识别颗粒[SRP]，或双精氨酸迁移[TAT]导出），这种现象表明蛋白质导出方式可以影响N-糖基化效率。我们也建立工程培养基蛋白定位到周质外的环境，比如外膜，膜囊，和细胞外培养基，这些可以作为N糖基化培养基。两者合计，我们的结果表明，空肠弯曲菌N-糖基化的组织与大肠杆菌中的不同的分泌机制是亲和的，有效扩大重组大肠杆菌N–糖组。此外，这个简单的糖基化标签策略扩大

3、了糖工程工具箱和打开了细菌合成一大批重组糖蛋白结合物的大门。前言天冬酰胺连接（N连接）蛋白糖基化是至关重要的且保留在真核生物有机体中。它是最普遍的所有蛋白质翻译后修饰，影响到近70%的真核蛋白质组。结合到真核分泌和膜蛋白上的聚糖附属物可影响蛋白的折叠和稳定性，齐聚，抗水解，排序，和运输。N-连接的糖基化发生在内质网（ER）中且涉及到内质网膜脂质载体上多糖的装配,其次是转移到特定的天冬酰胺残留的目标多肽上。最初，N–连接糖基化只发生在真核生物中。然而，N-糖蛋白现在已经被描述到生活的所有领域，包括古菌和最近的细菌，其中最具特征的例子是人类胃肠菌空肠弯曲菌（Campylobacter文档实用

4、标准文案jejuni）。在空肠弯曲菌中，参与这个途径的基因组包括一个17-kb命名为pgl的蛋白糖基化基因。迄今，超过40种周质和膜糖蛋白已被确定为空肠弯曲菌，且大多数这些绑定到N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）-特效血凝大豆凝集素（SBA）。质谱和核磁共振共振（NMR）的研究显示，N连接聚糖就是GlcGalNAc5Bac，这里Bac是细菌糖胺（2,4-二乙酰氨基-2,4,6-三脱氧葡萄糖）。这个分支七糖通过按次序添加在脂质载体上的激活核苷酸糖以及细胞质内膜表面的十一碳烯焦磷酸酯来合成。一旦装配完，脂连的七糖通过假定的ATP结合盒（ABC）运输人PglK快速翻转通过膜。七糖通过一种叫Pgl

5、B的寡糖传输酶（OST）催化转移到了周质培养基蛋白上。PglB是单个完整的膜蛋白，和催化真核亚基OSTSTT3有明显的顺序相似性。PglB把七糖固定在天冬酰胺酸上，以D/E-X1-N-X2-S/T为基本图案（在这里X1，X2是除脯氨酸外的任意残基），一种相似于真核细胞糖基化位点的位点。近期Wacker和合作者把整段空肠弯曲菌（C.jejuni）pgl基因转移到大肠杆菌上，赋予这些分子使蛋白质糖基化的能力。天然空肠弯曲菌（C.jejuni）糖蛋白例如Peb3和AcrA能通过Sec途径定位到周质，在具有糖基化能力的大肠杆菌中N糖基化。AcrA通过双精氨酸转运途径（Tat）运输时也能N糖基化，

6、Tat途径因为能通过内膜导出折叠蛋白的能力而众所周知。除了周质蛋白，一些天然空肠弯曲菌（C.jejuni）N-糖蛋白基于生物信息分析被预测为完整的膜蛋白。共同的，这些早期的研究表明空肠弯曲菌（C.jejuni）N-连接糖蛋白组织与不同的分泌机理亲和，能容忍从不折叠多肽到完整折叠蛋白域（虽然高度复杂且溶剂暴露）。然而受到膜迁移和细菌上受体蛋白折叠的影响，糖基化还没有被完全完成。定位到周质外的蛋白，例如外膜或细胞外培养基是否与N糖基化亲和还不知道。因此，本文的目的在于研究不同分泌和细胞外蛋白培养基在带有pgl基因大肠杆菌分子中N糖基化的程度。为了解决这个问题，我们开发了一种基因编码N聚糖受体

7、多肽标签（GT），它能附加在末端或植入重组蛋白内部位置。许多用GT来修饰的重组蛋白在表达pgl基因的大肠杆菌菌株中可靠地被糖基化了。当GT被用来和通过不同输出途径（e.g.,文档实用标准文案Sec,信号识别颗粒[SRP]，或Tat）定位到周质上的蛋白质结合时，我们发现这些蛋白质在糖基化模型中的一个明显不同之处，这取决于他们在内膜上迁移的模式。在所有测试的事例中，通过GT的N聚糖附属物没有对蛋白质活性产生任何可测量的影响。最后我们发现