leture基因表达与蛋白质纯化

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1、复旦大学生物化学系黄伟达whuang@fudan.edu.cn2004年5月18日基因表达与蛋白质纯化技术探讨内容基因表达体系及优劣势大肠杆菌中表达蛋白质可能碰到的问题基因工程的应用领域1.蛋白质功能研究2.生物制药和疫苗生产3. 疾病的基因治疗4.食品、化工用酶制剂5.抗虫、抗逆植物改良6.细胞代谢产物的富集基因表达体系1.原核体系2.真核体系大肠杆菌(Escherichiacoli)遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高；基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构

2、)，无加糖等修饰枯草杆菌(Bacillussubtilis)分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构；无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解；质粒不稳定，尚无商品化的表达载体其他乳酸菌(Lacticacidbacteria)沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)真核细胞表达体系酵母细胞昆虫细胞哺乳动物细胞/组织植物细胞/组织酵母细胞可生产分泌型蛋白；有天然立体结构，有加糖修饰功能；可进行染色体整合型基因表达;

3、糖链与哺乳动物加工的不一致，培养上清多糖浓度高;商品化表达体系：酿酒酵母（Saccharomycecerevisiae）;毕氏酵母(Pichiapastoris);裂殖酵母（Schizosaccharomycepombe）昆虫细胞可以病毒感染的型式在成虫中生产，也可在体外培养细胞中生产蛋白;适合分泌型和膜蛋白的表达，有加糖修饰；糖链有所区别，表达量有限；作为药物宿主细胞未被FDA认可CHO细胞可进行分泌表达，有天然立体结构，加糖方式与人体蛋白质完全一致；表达量不够高，培养成本较高植物组织植物可大面积

4、种植，可以廉价大规模生产；转基因植物制作费时，表达的组织特异性较难控制；表达量较难提高，分离纯化不方便动物乳腺组织分泌生产有天然立体结构和活性的蛋白质至乳汁，产量高，分离纯化方便，特别适合药用蛋白的生产；转基因动物制作花费巨大，实验周期长鸟类输卵管组织分泌生产有天然立体结构的蛋白质到蛋清，产量高，容易贮存和运输，分离纯化方便；实验成本低，饲养费用低；加糖方式可能与人有所不同体系选择研究基因功能:大肠杆菌,裂殖酵母,昆虫细胞,CHO细胞多肽药物生产:大肠杆菌,毕氏酵母,CHO细胞,乳腺组织疫苗:大肠杆

5、菌,酵母,大多数沿用细胞培养产物进行灭毒单抗生产:杂交瘤细胞工业酶生产:各种微生物在大肠杆菌中直接生产有活性的胰岛素在大肠杆菌中生产人凝血IX因子在大肠杆菌生产Calcitonin类C端酰胺化短肽在大肠杆菌中进行蛋白质的糖基化修饰在酵母中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化在鸡输卵管中进行与哺乳动物细胞一致的糖基化提高乳腺分泌表达的FactorIX类因子的活性在植物中得到与哺乳动物细胞一致的糖基化有可能以后做到的事在大肠杆菌中表达外源基因按蛋白质类型分单纯表达:pJLA系列,用NcoI/Nd

6、eI导入AUG的载体融合表达:融合各种tag,GST,CBD,MAL,GFP,etc分泌表达:pel/ompT分泌肽按启动子分lac及衍生的tac,trc,pac,rac等启动子IPTG诱导lamdaphagePL和PR启动子热诱导T7启动子IPTG诱导T5启动子IPTG诱导ara启动子阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达载体分类pJLA50X系列;pcDNAII;etcpET系列(T7promoter,Novagen公司)pQE系列(T5promoter,Qiagen公司)pMAL系列(周质表达,BioLab

7、s公司)pGEX系列(GST融合表达,Pharmacia公司)pBAD系列(Arabinose诱导型)常用表达载体pTYB系列(CBD融合,可以自我切割,BioLabs)ProteinAGST（glutathioneS-transferase）CBD(chitin-bindingdomain,BioLabs;cellulose-bindingdomain,Novagen)calmodulin-bindingdomain,Stratagene)MBP(maltose-bindingprotein)GF

8、P(greenfluorescenceprotein)Thioredoxin**帮助二硫键形成Dsb(periplasmaenzymeDsbA,DsbC)**二硫键的形成与SUMO(smallubiquitin-relatedmodifier)KSI(ketosteroidisomerase)基本上全部沉淀各种融合蛋白表达载体帮助可溶化帮助分泌到周质可用亲和层析纯化His-tag(6-8Histidine)T7-tag(MASMTGGQQMG)HSV-tag(QPEL