利用定点诱变提高木聚糖酶热稳定性的研究

《利用定点诱变提高木聚糖酶热稳定性的研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、河南农业大学硕士学位论文利用定点诱变提高木聚糖酶热稳定性的研究姓名：王会娟申请学位级别：硕士专业：微生物学指导教师：贾新成;张世敏20070601致谢本文是在我的导师贾新成教授、张世敏副教授的悉心指导下完成的。除了在选题、查阅文献、实验技术、论文写作等多方面的给予具体指导外，导师认真严谨、一丝不苟的治学精神更使我受益非浅。在实验过程中，吴建宇教授、吴坤教授、邱立友教授、陈红歌副教授、宋安东副教授、刘亮伟副教授就实验中出现的问题提出了很多建议。赵柏叶老师、胡渝老师、赵玉萍老师、为实验的顺利进行提供了诸多便利。从实验的开始到结束，和同学的互相合作，实验工作得到了顺利进行，同时也和他们建立了深厚的

2、友谊。刘寅、胡元森、刘亚峰师兄在实验初始阶段给予很大帮助。范琳琳、杨峰晓同学也在试验中做了不少的工作。在和王兰青、孙富林、李浩、朱广军、李彦鹏、康静、张品品、鲁晓娟、吕帅、高文静、张建、陈克、孙强、冯冲、郑茜、董庸行、李安华、王艳君等同学三年的共同学习和实验室工作中，得到他们很多的帮助。在此谨向关心和帮助我的老师和同学表示衷心的感谢。最后，谨将我的论文献给我的父母、师长和朋友。在我三年求学生涯中，是他们无私的鼓励和支持使我顺利完成了学业，是他们帮助我克服了许多困难。微生物学硕士论文利用定点诱变提高木聚糖酶热稳定性的研究摘要本研究是利用定点诱变技术提高木聚糖酶的热稳定性。定点诱变是普遍用于分子

3、生物学和生物化学的有效方法。随着PCR技术的发展，为定点诱交开辟了一条新途径。PCR介导的定点诱变与传统的定点诱变相比，无需制各M13单链噬菌体载体，缩短实验所需的时间，并且可以使突变体大量扩增，从而提高诱变效率。若所需突变位点位于DNA两端，可以直接用突变引物进行PCR，得到突变体；若所需突变位点不在DNA两端，则利用重叠延伸PCR法进行诱变。木聚糖酶能降解木聚糖成木糖或木寡糖，在饲料、造纸、食品以及能源工业中有着广泛的用途。木聚糖酶核心区域极其稳定，在靠近可变的a螺旋C一端构建二硫键，可能会提高木聚糖酶分子的热稳定性。通过在蛋白质的N末端附近一个残基的置换和嵌合改变，引入二硫桥，使木聚糖

4、酶的稳定性得到很大的提高，同时也可通过突变获得扩展在碱性pH下的活性范围。本实验室克隆的得到的木聚糖酶基因DQl47775与已经报道的木聚糖酶基因AY536638仅有3个核苷酸不同，二者同源性高达99％以上。而DQl47775与AY536638相比在3端少5个碱基而不完整。在对木聚糖酶基因DQl47775进行蛋白质Blast、DNABlast和大量参考文献的分析基础上。通过PrimerPremier5．0和Oli906．0设计了6条突变引物。在引物Ao中加入5个碱基，补齐632--6365个碱基，增加了一个丝氨酸和一个终止密码子。第二对引物：Sl在原蛋白质序列的第3位和第5位增加半胱氨酸(3

5、c／5C)。Al在原蛋白质序列的第212位增加一个半胱氨酸(212C)。第三对引物：在原蛋白质序列的第39位甘氨酸替换为半胱氨酸(G39C)。上游引物和下游引物有20个碱基是重叠的。通过重叠延伸PCR的得到的片断1有141个碱基，片断2有525个碱基。通过组合，用OE．PCR和PCR扩增获得8个突变基因。突变基因经过酶切、酶连、转化。经电泳鉴定，突变基因确实克隆到质粒pYES6上。将含有突变基因的重组质粒转化入酿酒酵母中。在酿酒酵母中进行诱导表达。以空质粒为对照，以完整酶为标准，在以不损失酶活为前提下筛选热稳定性最好的突变体。筛选到突变体8号。酿酒酵母1NVScI中高效表达的重组酶最适温度为

6、55℃，最适pH为4．0，在55"C的半灭活时间为15rain。在60"C的半灭活时间为5min，最适温度提高了5"C。最适pH改变不大，热稳定性有提高。关键词。木聚糖酶；定点突变；热稳定性；酿酒酵母；二硫桥；体外诱变微生物学硕士论文利用定点诱变提高木聚糖酶热稳定性的研究1．文献综述对酶分子的改造，几十年来的工作都着眼于两个方面，一是基于序列的合理化设计方案，如化学修饰等；二是利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程的非合理设计方案，如定向进化等。对酶分子的研究可分为认识和改造两个方面，前者利用各种生物化学、晶体学、结构和功能之间关系等方面的信息，以此为依据对酶分子进行改造，成为酶分子的合理

7、设计；与此相对应，不需要准确地酶分子结构信息而通过随机突变、基因重组、定向进化等方法对其进行改造，则称为酶分子的非合理设计。为了获得更高的木聚糖酶酶活及提高木聚糖酶对极端环境(高温、强碱)的耐受能力，使木聚糖酶具有更高的工业应用价值，不少研究者开始了利用分子生物学手段来改造木聚糖酶的尝试。主要集中在两个热点：一个是对信号肽加以改造以提高木聚糖酶的表达量，另一个是构建二硫桥以提高酶分子的耐受力。1。1体外诱变体