重组新城疫病毒NDVrAnhEGFP的构建及其抑制肿瘤效果的研究

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1、东北农业大学硕士学位论文重组新城疫病毒NDV-rAnh/EGFP的构建及其抑制肿瘤效果的研究姓名：颜世君申请学位级别：硕士专业：生物学；微生物学指导教师：任桂萍20110609摘要癌症是人类死亡的主要病因。在临床癌症治疗中，传统的化疗和放疗治疗疗效有限，并具有强烈的毒副作用．促使科研学者寻找新的肿瘤治疗手段。应用溶瘤病毒治疗肿瘤是近年来发展非常迅速的一种肿瘤治疗策略。新城疫病毒(Newaestlediseasevirus，NDV)为单股负链RNA病毒，隶属副粘病毒科禽副粘病毒属。NDV能够选择性在肿瘤细胞内复制，而对人正常细胞无明显影响。因此，目前新城疫病毒作为溶瘤病毒正在被广泛地

2、应用于肿瘤治疗。而反向遗传学操作技术的应用使得通过对病毒基因组的改造进一步增加病毒的疗效及安全性成为可能。新城疫病毒Anhinga株最早是在美国佛罗里达州动物园圈养的鸟类中发现的，属于中等毒力株。目前，尚未有Anhinga株应用于肿瘤治疗的研究报告。本研究主要探讨利用反向遗传操作技术构建的重组新城疫病毒Anhinga株在癌症治疗中的有效性。首先在HN基因和L基因之间插入了增强型绿色荧光蛋白基因的开放阅读框，并同时添加了相应的转录调控序列GE和GS，最终构成了带有EGFP基因的NDV全长eDNA。携带全长eDNA的转录质粒与分别表达核衣壳蛋白、磷酸化蛋白、大聚合酶蛋白的辅助质粒共同转

3、染能够稳定表达1"7RNA聚合酶的BSRT7／5细胞。拯救得到表达增强型绿荧光蛋白的重组新城疫病毒1、DV二rAnh／EGFP首先通过鸡胚进行增殖并收获尿囊液。通过观察EGFP在NDV-rAnh／EGFP感染的活细胞中(BSRT7／5)的表达情况证实表达外源基因的重组新城疫病毒拯救成功。将NDV二rAnh／EGFP在鸡胚中连续传代15代，鉴定得知所插入的重组新城疫病毒外源基因可以持续稳定的表达。在HepO．2细胞中进行的重组病毒增殖实验表明，外源基因片段EOFP的插入并未对病毒的增殖造成影响。在体外实验中，利用MTT方法检测不同病毒滴度NDV-rAnh／EGFP对几种肿瘤细胞的抑制

4、作用。结果表明，NDV-rAnh／EGFP可以有效地抑制肿瘤细胞的生长。但是，对于不同肿瘤细胞，抑制效果大不相同。NDV-rAnMeGFP对肿瘤的抑制作用呈现剂量依赖性并且与病毒本身在不同肿瘤细胞中的复制能力有关。为了在体内试验中检测重组NDV二rAnh／EGFP对肿瘤的抑制作用，建立昆明小鼠1-122腹水瘤模型和H22皮下实体瘤模型，分别通过腹腔注射和瘤内注射NDV-rAnh／EGFP治疗肿瘤，结果表明重组新城疫病毒可以有效延长H22腹水瘤模型小鼠的生存时间，抑制H22肝癌实体瘤生长。综上所述，本实验应用反向遗传操作技术，成功拯救重组新城疫病毒NDV-rAnh／EGFP株。在体外

5、实验中证实NDV二rAnh／EGFP能够有效的杀伤多种肿瘤细胞，且对不同肿瘤细胞的抑制作用不同。同时在体内实验中，重组新城疫病毒也表现出良好的治疗效果。本研究为重组新城疫病毒作为病毒疫苗载体应用于肿瘤治疗搭建了重要的技术平台。关键词重组新城疫病毒；反向遗传操作技术：加强型绿色荧光蛋白；肿瘤细胞；荷瘤鼠模型AbstractConstructionofrecombinantNDV-rAnh／EGFPandinvestigatkof‘tsinhibitor3abilit)nvestigationofitstumornhibitorvabilitylCancerisamajorcauseo

6、fdeathsinhumans．Inclinicalcancertherapy,thelimitedefficacyandtoxicitiesofcurrentchemotherapiesandradiotherapieshaveprovidedallimpetusforthesearchofnewtherapeutics．Newcastlediseasevirus(NDV)isallavianparamyxoviruswithanegative·strandedRNAgenomethatbelongstothegenusAvulaviruswithintheParamyxovir

7、inaesubfamilyoftheParamyxoviridaefamily．Ithasanaturalpreferenceforreplicatingintumorcellsbutnotinnormalcells．Therefore，NDViscurrentlyunderinvestigationsforoncolyticvirotherapy．Reversegeneticsmanipulationtechniquenowallowsgeneticmanipula