肝癌发生过程中的差异基因表达谱研究

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1、郑州大学硕士学位论文肝癌发生过程中的差异基因表达谱研究姓名：白阳秋申请学位级别：硕士专业：消化内科指导教师：杨玉秀20070510郑州人学2007届硕Jj毕业论史J}丁籀发生过程中的差异幕W表达讲研究肝癌发生过程中的差异基因表达谱研究研究生白阳秋导师杨玉秀河南省人民医院消化内科河南郑州450003摘要背景与目的肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC，简称肝癌)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率第5位，死因第3位；其发病率和死亡率有逐年上升趋势。我国乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus，HBV)感染是导致慢性肝炎、肝硬化和肝癌发

2、生的主要原因，每年死于肝癌的人数达到ll万，居我国癌症死亡的第二位。肝癌发病十分隐匿，临床上仅有不到30％的病人就诊时可获得手术治疗的机会。对大多数中晚期患者，治疗的选择很局限，预后凶险。肝癌自然病程短，进展快，病死率高，严重威胁着我国国民的健康和生命。肝癌的发生发展是一个复杂的多病因、多阶段、多因素参与的过程。肝癌的发生一般要经过慢性肝炎一肝硬化～肝癌的病理过程，其中涉及到众多基因异常表达改变。抑癌基因的突变缺失、癌基因的异常扩增与表达、多基因的协同作用，基因本身的多效性以及机体免疫因素决定最终肿瘤表型的表达。用一次只能检测少量基因且操作复杂费时的传统实验方法研究肝癌基因改变有很

3、大的局限性，新近发展的基因表达分析平台——基因芯片技术以其自身的高通量、微量化、平行化、自动化检测优点从众多方法中脱颖而出。基因芯片技术是以微阵列方式将大量特定高密度寡核苷酸或基因片段固定在某种介质(玻片、硅片、尼龙膜等)上，检测特定基因表达的一项技术。基因芯片技术的理论基础是核酸杂交。基因芯片技术可以准确高效的同时在全基因组范围内同时分析待测样本中成千上万个基因的表达情况以及它们之问帽互作用的关系。本研究采用含19378个已知基因的AffymetrixU133plus2．0寡核苷酸基因芯片研究正常肝脏、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌组郑州大学2007屙顾I：毕业论文HT瘵发生过程中的

4、差异基冈表达辫研究织基因表达谱，对共同表达的差异基因进行分析，探讨相关基因变化与肝癌发生过程中的可能内在联系。材料与方法正常肝组织9例，慢性乙型肝炎(以下简称肝炎)组织13例，乙型肝炎肝硬化(以下简称肝硬化)组织6例，HBV相关性肝癌组织15例。肝炎组织取自安阳市五院2006年2月--2006年4月肝活检组织，余均取自河南省人民医院2005年3月～2005年6月肝脏手术切除组织(正常肝组织取自健康供体)。肝炎、肝硬化、肝癌组织标本HBsAg均阳性，正常肝组织HBsAg阴性。疾病诊断均经病理证实。标本取出后迅速置于滚氮冷冻，冻存待用。按lnvitrogen公司的Trizol试剂盒操作

5、程序Trizol一步法抽提正常肝组织及肝炎、肝硬化和肝癌组织总RNA。使用QIAGEN公司的QIAGENRNeasyKit进一步纯化总RNA。琼脂糖凝胶电泳(180v,0．5h)检测总RNA的28S和18S比例，以评估总RNA的完整性；用分光光度计在260／280nm测定总RNA吸光度，以计算总RNA的纯度。按Affymetrix公司芯片制作要求，进行生物素标记的cRNA合成，并将其片段化处理。然后分别与含有19378个已知基因的寡核苷酸芯片进行杂交，GenearrayScanner30007G激光共聚焦扫描，采用GenePixPro3．0软件读取芯片探针信号并进行扣本底、标准化处

6、理，计算基因的Ratio值(肝炎、肝硬化、肝癌芯片探针信号／jF常肝组织芯片对应探针信号)。差异基因筛选标准：Ratio>__2为上调基因，Ratio<_0．5为下调基因。采用MicrosoftExcel及Gominer软件对差异基因数据进行分析。查阅NCBI(http：／／www．pubmed．corn)，GENEONTOLOGY(http：／／www．geneontology．org)，KEGG(http：／／www．biorcart．eom)数据库，获取肝癌相关基因信息。结果1．各组总RNA提取结果良好，总RNA的吸光度OD260／OD280值均在1．8～2．0，热稳定实验显

7、示70℃lh与20"Clh电泳条带比较，28s条带无明显降解，mRNA主要集中于O．9～4．0kb的连续条带。电泳结果证实已抽提高纯度的RNA。2．本实验结果完全符合AffymetrixU133Plus2．0基因芯片质量控制标准，信号强度达到要求。检测系统正常，保证杂交结果的可靠性。3．以正常肝组织为对照比较，筛选出肝炎、肝硬化、肝癌差异基因表达谱。通Ⅱ郑州大学2007届硕I：毕业论文肝癌发生过程中的差异皋W表达谱研究过对其进行生物信息学比对分析，筛选出在肝炎、肝硬化