苦参碱对HL60细胞增殖与分化影响的实验研究

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1、苦参碱对HL-60细胞增殖与分化影响的实验研究作者：李玉红，许浪，晏丹，刘丹【摘要】　　目的观察苦参碱对HL-60细胞增殖和分化的影响作用。方法以HL-60细胞为实验对象,采用体外培养技术,通过MTT法测细胞活力、细胞周期分析、细胞凋亡检测、硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验、细胞表面分化抗原检测等方法来观察不同浓度苦参碱对HL-60细胞的作用。结果浓度为12.5～50μg/ml的苦参碱能明显抑制HL-60细胞的增殖，使细胞周期发生改变，G0/G1期细胞增多，S期细胞减少，凋亡细胞明显增多，对NBT的还原能力增强，细胞表面分化抗原CD11b和CD15表达增加。结论苦参碱对白血病细

2、胞具有一定的抑制增殖、诱导凋亡和诱导分化作用，对白血病的治疗提供有力的实验依据。【关键词】苦参碱；HL-60细胞；增殖；分化　　苦参碱(matrine,MAT)是传统中药苦参的有效成分,9研究报道苦参碱类药具有显著抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤分化和凋亡、抗肿瘤浸润和远处转移、抑制肿瘤新生血管形成、减轻肿瘤炎症和抑制肿瘤耐药性、减低化疗不良作用、增强肿瘤宿主免疫等功能［1］。本实验观察苦参碱对HL-60细胞增殖与分化方面的影响，并对其作用机制进行初步探讨，以期对白血病的治疗提供一些新的思路。　　1材料与方法　　　1.1细胞系和主要试剂HL-60细胞系为武汉大学流行病学实验室所赠，苦参

3、碱购于广州明兴制药有限公司，用RPMI1640培养基稀释，过滤除菌保存,临用时用适量的培养基稀释至实验所需浓度。RPMI1640培养基为GIBCO公司产品，硝基四氮唑蓝(NBT)为上海前进化学试剂厂产品，PE标记的小鼠抗人CD11b单抗和FITC标记的小鼠抗人CD15单抗购于晶美生物工程有限公司。　　1.2细胞培养及苦参碱处理HL-60细胞培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中。置37℃、饱和湿度的5%CO2孵箱中培养，2～3d换液传代1次，取对数生长期的细胞进行实验，实验细胞起始接种浓度为1×105/ml。将细胞分为4组，分别加入苦参碱使其终浓度为0（对照组），1

4、2.5，25，50μg/ml进行后续观察。　　1.3MTT法检测细胞活力台盼蓝染色记数活细胞＞95%后，将细胞转入96孔培养板培养，每孔加入用不同浓度的苦参碱处理72h的细胞悬液200μl，设重复孔3个，向各孔中加入20μl的MTT(5mg/ml)溶液，37℃,5%CO2培养箱孵育49h后，终止培养，平板离心弃上清，每孔加100μlDMSO，微量振荡器振荡10min，使结晶物充分融解，显微镜观察至甲臜充分溶解后，用国产DG3022型酶标仪测各孔在波长570nm和630nm处的OD值，将OD570减去OD630即为测定结果。　　1.4细胞周期分析分别收集上述经不同浓度苦参碱处理

5、72h的HL-60细胞，离心5min，弃上清液，PBS洗涤两次,每份样品加RNase100μl，PI(含0.1%Triton-X100)300μl单染30min，37℃避光保存，经流式细胞仪检测细胞周期时相分布，上机时300目尼龙网滤过，计数10000个细胞。　　1.5流式细胞仪检测细胞凋亡率分别收集上述经不同浓度苦参碱处理72h的HL-60细胞，离心5min，弃上清液，PBS液洗涤细胞两次。用结合缓冲液将细胞浓度调整为1×106/ml，取100ml，加入5μlAnnexinV和10μlPI溶液，混匀，室温避光孵育15min后加入400μl缓冲液，上机检测。正常活细胞为:An

6、nexinV（-）/PI（-），早期凋亡细胞:AnnexinV（+）/PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞:AnnexinV（+）/PI（+），机械性损伤细胞:AnnexinV（-）/PI（+）。　　1.6NBT还原能力测定分别收集上述经不同浓度苦参碱处理72h的HL-60细胞，离心5min，弃上清液，PBS9液洗涤细胞两次，调整细胞浓度为1×106细胞，加0.5ml含0.1％NBT及200ng/ml鞣酸(TPA)的生理盐水，37℃保温60min，离心弃上清，将沉淀细胞均匀涂片，Wright-Giesma染色，油镜下计算阳性细胞数。　　1.7细胞表面分化抗原检测分别收集上述经不

7、同浓度苦参碱处理72h的HL-60细胞，离心5min，弃上清液，PBS液洗涤细胞两次，调整细胞浓度为1×106细胞，分别加入PE标记的小鼠抗人CD11b单抗、FITC标记的小鼠抗人CD15单抗1ml，混匀后避光反应20min,用PBS洗液洗涤，离心，加0.5mlPBS洗液重悬细胞，流式细胞仪检测。　　2结果　　2.1苦参碱对HL-60细胞的生长抑制如图1所示，苦参碱对HL-60细胞生长抑制作用呈浓度依赖性，12.5μg/ml的苦参碱显示具有明显抑制作用，随着浓度的增加其抑制作用进一步增强，与对照组有明显