血管内皮细胞生长因子可溶性受体克隆、表达及其对血管生成抑制作用

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1、中国医科大学博士学位论文血管内皮细胞生长因子可溶性受体克隆、表达及其对血管生成抑制作用姓名：周彩存申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：康健2001.3.1血管内皮细胞生长因子可溶性受体克隆、表达及其对血管生成抑制作用中文摘要血管生成意攒来源予现有血管的新生形成新的血管；它在发育、伤口的修复、慢性炎症霸一些病瑾改交如糖尿病整撬弼膜病交、风温缝关节炎释癌症等巾发挥重要作用。许多霹究表明肿癯具有游导血管凝生懿能力，扶藤为其生长和转移提供黄葬与门户；实体肿癌组织血管密度较周围正常组织明显增加。并与多种肿瘤患者(乳房、结肠、肺、肾等)预后星负相关，与转移

2、程度燕正褶美。由此可觅，肿瘤诱导血管新生的能力决定它的生长速度和转移能力。医此，{零铺肿癣血管垒成就熊有效地控镧肿瘤的生长等扩散，而成为当今牌瘿治疗研究的热点之一。肿瘤血管生成是微血管生长正负调节因子动态平衡失调的结果，主要表现为血管生长促进因子表达的增加。尽管许多因予体内外能够促进血管生成，僵在缺氧条件下。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是血管形成的最重要的调蒂剂，它作用最强、特异性高；在多种肿瘤组织中表达水平弼显增加。抑制VEGF熊控制视曜膜血管薪生和辨瘗生长。已掇遂彳许多方法．-7{牵制VEGF的功能，如VEGF反义核酸与单挽、应用血管抑制因

3、子秘VEGF一毒素偶联物等。VEGF是通过内皮细胞膜上受体(VEGFR)：VEGFR一1／fit—l与VRG-FR一2／kDR的介导来发挥作蒂的。VEGFR属予酪氨酸激酶类，有细胞膜辨与VEGF结合区、跨膜区秘缨稳疼酪氮酸蛋自激酶；其mRNA的不同剪切，产生蕊种功熊完全不阏的受俺，其一为完整鳇受体，另一势只有与VEGF结合功船的可溶性膜外片段，对VEGF功越起负性调节作用。为此我们克隆并表达了VEGFR膜外片段，以探讨其生物学功能。一．VEGF受体KDRcDNA膜外5—7区的克隆与表达：许多鞲究发现VEGF受体KDR膜拜片段具有与VEGF结合功能，

4、而秸抗V嚣GF麴生物学作黑。我髓取薪鲜薪静脉(20cm长)三搬，瘫PBS反复冲洗干净后，用胶原酶消化收集血管内皮细胞。用Trizol试剡盒分离内皮缨胞总RNA。然后根据KDReDNA序列设计3与5端特异性引物，作RT_PCR，扩增KDR基因膜外部分5—7区，并使之分别与QIA原核和Piehia醇母表这质粒连接，转染大脑梓茵TGl和ToplO；抗性筛选，双向溺序。分别耀IPTG翔甲磐诱导表达，SDS—PAGE电泳穰d跌一嚣LIZA鉴定表达产物。离心收集彤l’G诱导表达的大肠菌体，常癯抽取包含体，N夕一Sepharose6B亲和层析纯化。纯化产物分别用

5、lO倍体积的复性液1与复性液2透析弱次；离心收取上清液即为复性后的可溶性受体KDR重组蛋白。将黧组KDR器自包被子96孔板中过夜，牛斑清白蛋白封闭后，与不同含量的孀l—VEGF结会，测定每孔巾缒放射活性。结果：抗经筛选获褥的重组菌株进行双酶切鉴定，可见950bp左右大小的DNA片段插入刭震粒孛。取1000m∥mlZeoein抗性的Piehia酵母重缀克隆40株，用甲醇进行诱导表达72小时，阐收上清液作SDS—PAGE电泳和dot—ELISA分析，朱见到欲表达的暖的蛋白，说骥该表达系统可能不表达KDR基因片段。Ampieillin和kanamycin

6、抗性筛选得囊的重组M15太瑟蓠转化予，小蠹培养搁取质粒酶切鉴定，可见捶入曩熬基因片段。IPTG诱导表达8小时，SDS—PAGE电泳承有秘的产物的表达，表达量约占菌体蛋白总量的5％左右；分子约走42KD炭右，dot—EIlSA检测阳性，提示表达产物为目的表达蛋白。经时表达研究涿在诱导后4小时表达达到高峰。抽取的包含体经Ni“一Sepharose6B亲和层柝纯纯，纯痍这98％叛上。经复性，该重组蛋白其有与VEGF特异性结合的功畿。羔．可涪性VEGF受体FLT一1基因爽隆与表达VEGF受体FLT—I主要表达于血管内皮细胞和部分肿瘤细胞。是血管生成所磐须。

7、有研究发现可溶性FLT一1(sFLT一1)能特异地与VEGF结合，两摔铺其生物学功镳。沟既，我们按上述方法从入脐静脉血管肉皮细胞’中竟隧了sFLT—leDNA的l一3区；以鐾l：梅建了探核表达麓缰质粒pQE一肿一l，转染大肠耔菌TGl。测廖正确后，转染大肠抒蕙越15灏XL一1一blue；按上述方法诱导表达、产物鉴定、纯化、复性和生物活性鉴定等。此外还探讨：r不同培养纂(t墨、2×YT和高浓度肉汤培养)中，sFLT一1表达情况。结果：Ampicillin稀kanamycin抗牲筛选得到的M15大肠茵克隆，小量培莠撼取度粒酶甥鉴定，霹霓捶入目的差瓣片段

8、约1050bp。IPTG诱导表达5小时，SDS—PAGE电游示剪目的产物的表达，表达量小，不足蔫体蛋蠢总·2·璧酶l％；分