贯叶连翘植株再生体系的建立及Hyp基因表达的初步研究

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1、摘要贷nf．造翘(HypericumperforalumL)是一种药用植物，具有抗病毒、抗抑郁等作用，金丝桃素是其中的主要活性成分。本论文以贯叶连翘为材料，进行了组织培养、再生体系的研究，建立，较为稳定的贯叶连翘植株再生体系，为利用细胞培养大规模提取金丝桃素奠定了基础。同时，在已建立的再生体系的基础上，进{YTHyp基因(贯叶连翘中金丝桃素代谢途径关键酶的基冈)表达的初步研究，以期为金丝桃素的大量获取增添～条新的途径。本论文的主要结果如F研究了基本培养基、生长素、分裂素对组织培养及快速繁殖的影响，建立了贯叶连翘的快繁体系。结果表明：MS

2、培养基中添J3no．1mg，LIBA}U0．1rfIg／L6-BA最适合贯叶连翘组培苗的继代增殖；MS培养基中添3Ho．05．--0．08mgm的IAA可使生根率达90％以上；经过检测，贯叶连翘组培曲和愈伤组织中金丝桃素含量分别为0．769‰和0012‰。以贯叶连翘快速繁殖所得到的组培苗的茎段、叶片、根段为外植体，对再生体系进行了研究。结果表明：在MS(1／2N)培养基中添加0．5mg几的TDZ或o．5～1．0mg／L的6-BA，茎段不定芽再生效果最好：在MS培养基中添加1．O~2．0mg／L的zT比较利2-'DI片的分化；MS(1／2

3、N)培养基添加0．1mg／L的TDZ或O．1mg，L的6-BA比较利丁根段不定芽再生。通过本研究，建立了较为稳定的贯叶连翘植株再生体系。将目的基因∞垆克隆到双元表达载体pBll21I-，构建出pBll21-功p表达载体；采用农杆菌介导法及基闪枪法进行毋妒基因表达的初步研究，得到6个Km抗性愈伤组织，5个Km抗性不定芽。关键词：贯叶连翘，再生体系，金丝桃素，Hyp基因，表达AbstractHypericumpe咖ratumL，isamedicinallyimportantplantusedinthetreatmentofdepressio

4、nandvirus．Hyperieinisthemajoractiveconstitutent．ThispaperusingHypericum彤rforatumLasmaterial，establisheditstissuecultureandplantregenerationsystem．whichwillcontributetothelarge-scaleextractionofhypericin；ExpressionofHypgenewasalsostudied，hopingtofindanewwaytoobtainlargeam

5、ountsofhypericin．Themainresultswereasfollows：Theeffectsofbasalmedium，difierentkindsandconcentrationsofauxinsandcytokininsontissuecultureandrapidpropagationofHypericumperforatumL．werestudied．Theresultswereasfollows：MSmediumsupplementedwithIBA0．1mg／Land6-BA0．1mg／LWasmostsu

6、itablefortherapidpropagationofHypericumperforammL．．Therootingratereachedabove90％with0．05～0．08mg／LIAAonMSmedium．ThehypericincontentfromthetubeseedlingandcallusofttyperieumperforatumL．reached0．769‰andO．012％odividually．TheregenerationsystemofHypericumperforatumL．stem，leafan

7、drootwerestudied．ExperimentsshowedthatMS(1／2N)mediumsupplementedwithTDZ0．5mg／Lor6-BA0．5～1．0mg／Lwasgoodfordifferentiationofstem；ShootofleafwaseasytobeinducedonMSmediumsupplementedwith1．0--2．0mg／LZT；MS(I／2N)mediumsupplementedwithTDZO．1mg／L，or6．BA0．1mg／LWassuitablefordi髓ren

8、tiationofroot．Weformedakindofstableplantregenerationsystemthroughthestudy．TheTargetgeneHypwasinsertedin