反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的建立及应用研究

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1、◇型型塑燮塑型塑堕堂墼盟婴生————些堑燮反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的建立及应用研究专业：人体解剖与组织胚胎学研究方向：基因诊断姓名：张韧导师：何蕴韶教授中文摘要乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是对人类威胁最大的病毒之一。根据全基因组>8％的差异，liBV基因组分为A~H八个亚型。I-IBV基因型分布具有明显的地域特征。不同HBV基因型感染者具有不同的病情发展情况，对各种治疗药物的应答也不尽相同。因此，对I-IBV感染病人进行HBV基因分型具有重要的临床意义。目前已经有很多对HBV进行基因分型的方法，但是绝大部分相对来说都费时费力、成

2、本较高，不利推广使用。更重要的是，一个碱基的突变就足以影响这些方法的检测结果。反向斑点杂交方法(Reversedotblot,RDB)是一种基于PCI灌础之上的，并经过不断发展和完善的方法．反向斑点杂交可以区分有只～个碱基差异的序列。可以在装备一般的医院或实验室里进行。通过流过式杂交原理的结合使用，该方法变得更加准确和快速。第一章反向斑点杂交技术检测HBv基因型方法的建立目的：建立一种基于反向斑点杂交技术的检测HBv基因型的方法。该反向斑点杂交技术整合有最新的流过式杂交原理。所建立的方法对一个碱基突变不敏感。◇型型塑燮型婴型型型I墼丝塑塑．————业壁坠丝墼方法：使

3、用己知基因型的册v阳性标本建立反向斑点杂交检测的方法。通过分析Genebank上的序列来设计引物探针。摸索确定RDB方法的最佳反应条件。使用经过HBV定量试剂盒定量的临床标本来测定该方法的特异性和灵敏度。用广州来源的101例阳性标本的测定结果与多重PCR和测序方法进行比较。结果：通过调整杂交温度，能使得反向斑点杂交对单碱基突变不敏感。所设计的探针理论上可以准确检出所有Genebank上已知的HBV序列。这些探针RDB的最佳杂交温度是45"C。标本检测表明，所有的HBV阴性的标本都得到了相应的阴性结果。该方法的检测灵敏度为103～104拷贝／mI。该方法与多重PcR相

4、比有84％的一致性，与测序相比有96％的一致性。结论：建立的反向斑点杂交检测FIBV基因型的方法快速、可靠并且廉价。即使在一些没有特殊装备的医院里，该法亦可被用来进行临床样本的HBV分型检测。第二章反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的评价背景：HBV的DNA聚合酶缺乏校正功能，因而HBV基因组具有较高的突变率。在第一章中已经建立了反向斑点杂交检测HBV基因型的方法，该方法与其他方法比较有很好的一致性。但第一章的标本均来源于同一医院，地域差异不显著，并不能体现HBV高突变率对所建立方法的影响，也不能体现该方法临床适用的广泛性。目的：评价所建立的反向斑点杂交检测HBV

5、基因型方法临床适用的广泛性和准确性。方法：用建立的反向斑点杂交检测HBV基因型的方法，检测来源于中国各省份不同医院的723例HBV阳性血清标本。选取其中的HBV基因型为单型且测序结果清晰可读的标本，用于比较RDB方法结果和标本测序之后用NCBI在线分型的结果，以及与测序后进行系统进化分析的结果。分析这些标本与所用探针的匹配情况，分析单碱基突变对RDB方法的影响程度．4I．◇型型盟燮塑型塑麴塑邕些里堕————型塑：苎主兰垒堕结果：723例标本HBV基因型的检出率为97．6％．其中423例单型且测序结果清晰的标本，RDB与测序之后的系统进化分析结果完全一致。RDB与测序

6、之后的NCBI在线分型结果一致性为98．8％(418／423)。之后分析这些标本序列与探针差异得知，与相应探针有1个碱基差异的标本B型12例、C型38例，D型l例被成功分型。该方法还准确检出了l例与C型探针差异一个碱基的A型标本，8例与A型探针差异一个碱基的C型标本．结论：本研究所建立的方法能快速准确地对中国各省份来源的HBV进行分型。该方法有很强的l临床适用性，与测序法比较一致性较高。该方法可以被应用于国内各大小医院的临床的I-IBV分型检测。第三章反向斑点杂交技术检测I-IBV基因型方法的应用背景：已经建立的反向斑点杂交技术检测HBV基因型的方法具有快速、简便、

7、准确的特点。HBV基因型的分布具有明显的地域特征。不同I-IBV基因型感染病人病情发展不同，不同的I-IBV基因型感染病人发展为HCC，LC的风险也不同。但其分子机制的研究还鲜见报道。谚目的g研究HBV基因型在中国的分布情况。研究HBV基因型与临床指标的关系，研究肝癌病人中I-IBV基因型与其临床指标的关系，以期找到HBV基因型引起HCC发生风险的分子机制的一些线索。方法：用第二章的反向斑点杂交方法检测I-IBV基因型．检测了706例分别来自中国各省份的HBV阳性血清，用于分析中国各地HBV基因型的分布情况。用卡方检验fisher精确概率法，分析145例有I-I