《基因的克隆方法》PPT课件

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1、第三章基因的克隆方法前言基因是生物染色体上的一段DNA序列，具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。2基因的表达过程mRNA翻译成蛋白质基因组DNA3如何获得基因？——即基因的克隆方法基于基因产物的基因克隆方法基于基因加标签的基因克隆方法基于基因序列的基因克隆方法基于基因图谱的基因克隆方法4一、基于基因产物的基因克隆方法mRNA翻译成蛋白质1、根据蛋白质序列克隆目的基因2、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因5原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA文库中分离出

2、相应的基因。1、蛋白质序列克隆法6实用性：分离纯化蛋白质十分困难CysMetAspGluMetLysArgAsnIleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTC据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意！密码子有简并性现象！72、根据基因表达差异（mRNA）克隆基因基因表达的差异表现：一是基因表达的种类的不同；二是基因表达水平的改变。8差减杂交（SH）抑制性差减杂交（SSH）差异显示PCR（DDRT-PCR）DNA代表性差异分析（DNARDA）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）cDNA微

3、阵列已发展的相应基因克隆方法：9差减杂交（SH）最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究。超声波打断雌鼠的DNA（过量100倍）(XX)MboI完全消化雄鼠的DNA(XY)变性、复性去除共有序列BamHI酶切表达载体连接、转化、测序分析缺点：技术要求高，耗时，工作量大NO.1NO.2NO.310SH在mRNA研究上的应用机理：!!不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的cDNA量有限。特异表达基因的样本（TS）无特异表达基因的样本（RS）提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA转录转录过量杂交TS的CD

4、NA纯化、富集、扩增去除过量的RS的cDNA及杂交分子11基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；基因时空表达的研究：如根、茎、叶；不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。差减杂交技术的应用方面：121.2.2抑制性差减杂交（SSH）Tester样本mRNADriver样本mRNASfiIAcDNAcDNASfiIBAB混合，变性杂交过量ABPCR扩增5`3`13应用基因突变体的研究：如基因的表达与不表达基因时空表达的研究：如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照141.2.3差异

5、显示PCR（DDRT-PCR）最先由Liang等于1992年报道，目前已广泛在实验室使用。主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。5`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA155`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTA

6、TTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT1617具体操作：1、提取mRNA；2、特定引物（12分之一）反转录；3、特定引物和RP结合RT-PCR；4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较DNA带，从而找出差别DNA。18缺点：假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。19优点：简便、灵敏、高效、省时

7、，能快速显示mRNA的组成。所需的mRNA量少。各样本mRNA的差异可同时进行比较。扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。20二、基于基因加标签的基因克隆方法原理：主要是在生物基因组中插入外源的一段DNA，使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的DNA片段来克隆基因的方法。21外源DNA基因组染色体DNA基因A产生突变型分类：T-DNA标签法转座子标签法。22T-DNA标签法克隆基因技术路线：农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.用T-DNA片段做probe

8、筛选突变体文库，获得阳性克隆。用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。23野生株转基因株目的基因染色体T-DNA染色体T-DNA探针筛选转