GAS对巨噬细胞株RAW264.7功能的影响

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1、中文摘要GAS对巨噬细胞株RAW264．7功能的影响摘要目的：A族溶血性链球菌(GAS)是咽部、皮肤、软组织感染的常见致病菌，也是引起儿童中毒性疾病：猩红热、毒性休克综合征等的病原体，它的危害还在于可以导致感染后的自身免疫性疾病、风湿热、风湿性心脏病、肾小球肾炎、牛皮癣以及免疫性脑病等。链球菌入侵人体后，机体最初的天然免疫也和抗其他多种病原体一样，主要是定居的巨噬细胞和招募来的嗜中性粒细胞的作用，一些研究已经描述了A族链球菌通过各种途径干扰中性粒细胞的抗微生物活性，包括释放分子干扰中性粒细胞的募集，诱导中性粒细胞死亡等，但

2、是，A族链球菌如何逃避巨噬细胞强大的抗微生物作用国内外未有报道。本研究旨在探索GAS刺激凡删264．7巨噬细胞株后，对RAW264．7细胞的超微结构、细胞增殖，其表面分子的表达及其表达、分泌细胞因子等的影响，以进一步研究GAS的致病及其逃避免疫攻击的机制。方法：1将GAS分五个不同时间段刺激RAW264．7细胞，同时细菌刺激细胞数(MOI)分别设低菌量(2：1、5：1)、中等菌量(10-1、20．1、30：1)和高菌量(50：1、100：1)，及PBS阴性和LPS阳性对照，均三复孔，作用完毕弃菌及加抗生素杀死胞外菌后，于细

3、胞培养箱内继续培养三天，MTT法检测刺激前后RAW264．7的增殖情况。中文摘要2以低菌量、中等菌量和高菌量GAS刺激细胞90min时，通过透射电子显微镜观察RAW264．7超微结构的变化，利用TUNEL和ANNEXINV-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。3分别用GAS、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以MOI为5：1时刺激巨噬细胞90min，作用完毕继续培养三天，行流式细胞术检测RAW264．7细胞表面CD80、CD86、MHC．II的表达情况；应用Real．time．PCR检测不同刺激组RAW264．7细胞的IL．

4、1、IL．6、IL．23、TNF．Q、TGF．B等炎性细胞因子的转录水平变化，并通过ELISA检测刺激后细胞分泌IL．6的变化。4Real．time—PCR法检测低菌量GAS束IJ激小鼠三天后，腹腔巨噬细胞及脾脏表达IL．1、IL．6、IL．23、TNF．Q、TGF．13的变化。结果：1MTT结果显示，低、中菌量GAS对RAW264．7细胞增殖有促进作用，高菌量GAS对细胞增殖有抑制作用。2通过透射电子显微镜观察：低菌量细菌刺激细胞时，RAW264．7细胞的细胞器发达，功能旺盛，线粒体水肿，粗面内质网变粗糙；中剂量刺激时，

5、细胞器发达，有髓样溶酶体结构，提示细胞吞噬消化细菌不完全；高菌量刺激细胞时，细胞出现空泡，核膜不完整等细胞坏死表象。3TUNEL法和ANNEXINV．FITC法结果均显示：高菌量刺激RAW264．7时，细胞数减少是由于细胞坏死而不是凋亡。4半定量PCR及Real．time．PCR结果显示：低菌量GAS刺激RAW264．7时，细胞表达IL．1、IL．23及TNF．Q基因水平升高，而IL．6、TGF．13水平下降。中文摘要5以低菌量GAS、大肠杆菌金和黄色葡萄球菌刺激巨噬细胞，与对照组相比，各刺激组细胞表达CD80分子均升高，

6、且大肠杆菌升高最为显著，其次分别为金黄色葡萄球菌、GAS；大肠杆菌刺激组CD86表达水平升高，其余刺激组表达无明显变化；GAS刺激组细胞表面MHC．11分子的表达无显著变化，但大肠杆菌与金葡菌刺激组表达升高，且有统计学意义。Real．time．PCR结果显示：大肠杆菌和金黄色葡萄球菌刺激组RAW264．7表达IL．6等细胞因子的转录均增加，并且大肠杆菌刺激组升高明显，GAS刺激组IL。6转录反而下调。6通过Real—time．PCR检测，与对照组比较，低菌量GAS刺激小鼠后，小鼠腹腔巨噬细胞表达IL．1、TNF．a水平升高

7、，IL．6、IL．23、TGF．13变化不明显；小鼠脾细胞表达IL．1、IL．6、IL．23、TNF．Q、TGF．13水平均增高。结论：1低菌量GAS作用RAW264．7细胞：能够促进其增殖，使其吞噬功能活跃，其表达促炎症因子的基因水平升高，但使其IL．6、TGF．B表达水平下降，相关机制、信号转导通路等仍有待研究。2低菌量GAS、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌能促进RAW264．7细胞表面CD80、MHC．11分子表达，说明在一定程度上能增强巨噬细胞的抗原递呈作用，但GAS的这种作用不明显。3高菌量GAS对细胞增殖有抑制作用，

8、使巨噬细胞坏死而不是凋亡。中文摘要关键词：A族链球菌(GAS)；巨噬细胞；RAW264．7；细胞因子；细胞增殖英文摘要TheEffectsOilMacrophageRAW264．7infectedwithGASABSTRACTobjective：GroupAstreptococcus(GAS)isama