蓖麻粕中残留蓖麻毒素的ELISA检测

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1、蓖麻粕中残留蓖麻毒素的ELISA检测王宗义贺平丽张丽英杨文军李德发(中国农业大学农业部饲料工业中心，北京100094)摘要本文建立了蓖麻粕中残留蓖麻毒素的夷心EusA捡测方法。蓖麻粕样品经p}r7．4PBs提取使蓖麻毒素充分溶出后可直接用于EusA检测。在本文确定的实验务件下，蓖麻拍中杂质对蓖麻毒素的检测无显著影响．方法检出限小于2．5ng／mL．以蓖麻毒索表度(5—80r∥mL)对敷做较准曲线，酽=n娜。短高压灭菌锅n1MPa处理卯mill的蓖麻柏中耒检出蓖麻毒素，并以此作为蓖麻粕的阴性对熙。对卖际样品进行了测定。关键词蓖麻毒素EuSA蓖

2、麻粕蓖麻毒素是蓖麻粕中对动物危害最大的一种毒素。蓖麻粕必须脱毒才能作为饲料使用，给动物饲喂未经脱毒或脱毒不完全的蓖麻粕会造成中毒。研究表明．用未脱毒蓖麻粕饲喂山羊，蓖麻毒素最先使消化道和肾脏受到侵害，进而造成肝、脾和淋巴发生病变”J。对蛋鸡而言．饲喂未脱毒蓖麻粕，则表现为脱毛、停产、机体消瘦和内脏器官病变”j。给猪饲喂含30％热喷蓖麻粕(脱毒不彻底)的日粮，有胃底和肾出血及肝脏病变发生”1。蓖麻毒素的作用机制已经比较清楚，作为一种含有双链的核糖体失活蛋白，首先通过B链的运载进入细胞，经过还原作用释放A链，A链是一种高活性的N一糖苷酶，可从核

3、糖体rRNA上脱掉一个腺嘌呤，从而中断蛋白质的合成”J。关于蓖麻粕中蓖麻毒素的检测方法，有颜色反应法、红细胞凝集分光光度法”1和聚丙烯酰胺凝胶电泳法”1，但前两者灵敏度和特异性不高，后者样品处理烦琐费时。迄今较为实用的检测蓖麻毒素方法是与免疫相关的检测技术，如酶联免疫吸附测定”J、免疫层析技术”1和免疫传感器技术”1等。近年来又发展了蓖麻毒素的质谱分析技术⋯J，虽然能给出更为确定的结果，但样品处理复杂，成本高，也不适用于低含量蓖麻毒索样品的检测。目前，脱毒蓖麻粕作为蛋白饲料在畜牧养殖业已有应用，但我国尚没有脱毒蓖麻粕产品的国家标准或行业标准

4、以及相应的毒素检测标准。蓖麻毒素的检测方法，国内研究较少。本文旨在提供一个简便、快速可靠的蓖麻毒素检测方法，为规范行业市场和进一步改善蓖麻粕的脱毒工艺提供参考。l材料与方法1．1仪器和试剂酶标仪(&lIlIi8e，TECAN公司)；96孔高结合力酶标板(B10兀L，JET公司)；鼠源抗蓖麻毒素单克隆抗体和兔源抗蓖麻毒素多克隆抗体(防化研究院提供)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体(JackⅫl公司)；3，3’，5，5’一四甲基联苯胺(TMB)和牛血清白蛋白购自北京芭尔芘生物技术发展中心；少量蓖麻毒素标品按unJ．Y．(1986)“11的

5、方法制备；其他试剂购自北京化学试剂公司。1．2溶液配置1．2．1抗体包被液(o．015m出L的pH9．6的碳酸盐缓冲溶液)溶解l，599碳酸钠，2．939碳酸氢钠于蒸馏水中，定容至l000nd。1．2．2封板液溶解1．og牛血清白蛋白和50¨LTw”n一20于100．oIlll抗体包被液中。1．2．3pH7．4的磷酸盐缓冲溶液(PBs)溶解0．49磷酸二氢钾，5．89十二水合磷酸氢二钠，·527·箍营养与饲科研究进展169氯化钠，o．49氯化钾于2000Illl蒸馏水中，用pH计校准溶液的pH值。1．2．4抗体稀释液(含o．1％BsA的PB

6、s)溶解100rng牛血清白蛋白于100．0lIllPBS中。L2．5洗板液(PBsT)溶解O．5InlTween一20于1000“PBs中。1．2．6底物溶液底物溶液A(o

7、1moL，LpH5．0的磷酸盐一柠檬酸缓冲溶液)将48．51I】lo．05mol／L的柠檬酸溶液与51．5ndO．1moL／L的磷酸氢二钠溶液混合，用pH计校准溶液的pH值。底物溶液B(1nlg／111l的TMB乙醇溶液)溶解lO．Omg的TMB于10IIll无水乙醇中，加入20山O．1mol／L的硫代硫酸钠溶液。l

8、缶用前取10ml底物溶液A，加入1．O丌d底物溶液

9、B和10灿30％的过氧化氢。1．3蓖麻粕阴性对照样品的制备取适量待检蓖麻粕于高压灭菌锅中0．15MPa处理60min。1．4蓖麻毒素提取液的制备称取O，2—0．39经粉碎过40目筛的蓖麻粕于50血三角瓶中，加入25rnlPBs，于摇床上提取4h，用中速滤纸过滤于50lrII容量瓶中定容，用PBS冲洗三角瓶，过滤冲洗液，如此重复三次，最后用PBs定容至刻度。用PBS稀释50一100倍用于测定。1．5蓖麻毒素的EI腮A检测将鼠源抗蓖麻毒素单克隆抗体用抗体稀释液稀释成浓度为2彬lnl，每孔100一，4℃冰箱包被过夜(不少于12h)或37℃恒温包被

10、2h。每孔加入320止洗板液，放置2—3IIlin，并于吸水纸上拍干，如此洗涤3次。每孔加人150山封板液37℃恒温1h，洗板3次(同前)。每孔加入100山蓖麻毒素提取液37℃恒