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1、生化与分子生物学技术中山医学院生物化学与分子生物学教研室操作流程琼脂糖凝胶板的制备质粒DNA及酶切产物电泳（约1h）（10μl）酶切操作、保温（1-3h）质粒DNA提取原理与方法、实验操作纯化的质粒DNA（20μl）琼脂糖凝胶电泳结果观察结果分析与问题讨论9月23日9月30日DNA的紫外分光光度法定量测定实验三：DNA的琼脂糖凝胶电泳实验四：DNA的紫外分光光度法定量测定实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳法凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。根据制备凝胶的材料:琼脂糖电泳凝胶电泳聚丙烯
2、酰胺电泳一、琼脂糖凝胶电泳的功用琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidiumbromide,EB)染色,在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带,从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外,还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带,用于以后的克隆操作。二、实验原理：在pH值为8.0～8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向
3、正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。三、琼脂糖电泳分离DNA的范围琼脂糖可以形成各种形状、大小的孔隙度。琼脂糖凝胶分离DNA片度大小范围较广,不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA片段。琼脂糖通常用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。胶浓（%）溴酚蓝二甲苯青0.61kb10.6kb2kb
4、1.40.2kb1.6kb20.15kb四、电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝（bromophenolblue,Bb）呈蓝紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的迁移率比溴酚蓝慢。五、影响凝胶电泳的因素在电场中,在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移,其迁移速率由下列多种因素决定:1、DNA的分子大小:线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比。2、琼脂糖浓度 一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度
5、在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。3、DNA分子的构象 当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的,超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。4、电源电压 在低电压时,线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大,所
6、加电压不得超过5v/cm。5、嵌入染料的存在 荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的DNA,染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强,还会使线状DNA迁移率降低15％。6、离子强度影响 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。六、材料前期实验中提取的质粒DNA和其酶切产物，琼
7、脂糖(Agarose)七、设备 水平式电泳装置,电泳仪,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪或凝胶成像系统。八、试剂1、5×TBE电泳缓冲液：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA(pH8.0)20ml，定溶至1000ml。2、6×电泳载样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液（或30％甘油），贮存于4℃。3、溴化乙锭(EB)溶液母液:将EB配制成10mg/ml,用铝箔或黑纸包裹容器,储于室温即可。九、操作步骤1、取5×TBE缓冲液20ml加水至200ml,配制成
8、0.5×TBE稀释缓冲液,待用。2、胶液的制备：称取0.4g琼脂糖,置于200ml锥形瓶中,加入50ml0.5×TBE稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3、胶板的制备：将融化的琼脂冷却至50-60℃，而后到入制胶模具（预先插上样品梳子）中，待胶完全凝固后拨出梳子，取出胶块，放入加有0.5×TBE电泳缓冲液
