靶向肿瘤坏死因子β小分子抑制剂的筛选及其功能鉴定

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1、万方数据北京协和医学院中圈医学科学院硕士研究生学位论文硕士学位论文学校代码：10023学号：$2012014005靶向肿瘤坏死因子B小分子抑制剂的筛选及其功能鉴定所院：姓名：指导教师：导师小组：学科专业：研究方向：完成日期：血液学研究所孙亚薇许元富研究员罗鸿博教授细胞生物学肿瘤坏死因子小分子抑制剂2015年5月万方数据北京协和医学院tl-闫医学科学院颂}=研究生学位论文目录第一部分肿瘤坏死因子B原核表达载体的构建及其诱导表达中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2Abstract···⋯·⋯⋯·········

2、·····⋯⋯·⋯···⋯······⋯··3前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯15结1论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯21参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯23第二部分靶向肿瘤坏死因子0小分子抑制剂的筛选及其功能鉴定中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯25Abstract⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯28结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯34结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯37讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯38参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40绢；述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯41附录1常见英文缩略词⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49附录2溶液配制⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯50附录3发表文章⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯53致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

4、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯一54万方数据北京协和医学院中国医学科学院硕士研究生学位论文第一部分重组人肿瘤坏死因子13原核表达载体的构建、表达及活性测定中文摘要目的构建肿瘤坏死因子B的原核表达载体，并进行TNFIj的诱导表达，为后续TNF13的功能及其与小分子抑制剂相互作用的研究奠定基础。方法通过构建PAYZ-STII—hTNFB一6his，pET44hTNFB一6his两种不同的原核表达载体，并分别转化16C9和BL21(DE3)感受态细胞，经不同方法诱导表达目的蛋白并比较两种载体中hTNFB表达量大小的差异，选出蛋白

5、表达量最大的载体和菌株组合，并利用SDS-PAGE和WesternbBlot技术检测并鉴定，比较可溶蛋白和包涵体蛋白比例。利用高浓度尿素(8M)溶解包涵体，并利用稀释复性技术得到具有生物学活性的hTNFB，纯化后的hTNFB蛋白在小鼠成纤维细胞系L929上测试其杀伤活性。结果SDS—PAGE和WesternBlot结果显示表达产物可溶性蛋白比例较低，大部分以包涵体形式存在，透析复性逐级降低尿素的过程中出现蛋白沉淀现象，改换稀释复性方法复性后，蛋白复性液在L929细胞系上做活性测试，复性后的蛋白溶液可以引起L929细胞

6、的凋亡，具有一定的生物学活性。结论成功构建PAYZ-S]、II-hTNFp一6Ms，pET44EK／LIC—hTNF一6his两种原核表达载体，并利用包涵体变性和复性技术得到了具有生物学活性的肿瘤坏死因子B蛋白。关健词：肿瘤坏死因子B；原核表达载体；包涵体万方数据北京协和医学院中国医学科学院硕士研究生学位论文Cloning，ExpressionandIdentificationofRecombinantHumanTumorNecrosisFactorBAbstractObjectiveConstructdiffere

7、ntprokaryoticexpressionvectorsof‘INFBandinducetheexpressionofthetargetedprotein，andbuildabasisfortheinteractionbetweenhrlNFl3andthescreenedsmallmolecularinhibitor．MethodsConstructtwodifferentprokaryoticexpressionvector：PAYZ·-STII—·hTNFl3·-6hisandpET44一hTNFl3．6h

8、is．1lanfomtheminto16C9andBL21(DE3)competentcellsrespectively,andtheninducetheexpressionofhTNFl3viadifferentmethods．DetectandidentifythetargetproteinviaSDS—PAGEandWesternBlot