《蛋白质结构分析》PPT课件

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1、第二章蛋白质结构分析第一节蛋白质样品的准备进行结构分析的蛋白质样品，一般要求纯度>95％。这样的样品，通常是用色谱和电泳精制过的。一、SDS—PAGE纯化的样品从SDS-PAGE上分离的蛋白质必需经过特殊处理，使SDS浓度低于0.0005％，否则SDS会影响到胰蛋白酶的酶解，也会大大降低HPLC分肽时的分辨率。有报道指出，在2mol／L尿素存在下，用胰蛋白酶消化蛋白质时，如果SDS浓度>0.05％，则完全阻止了胰蛋白酶和内肽酶Lys-C的作用。虽然有报道用HPLC或用盐酸胍沉淀除去SDS，但不易掌握，尤其是共价结合到蛋白质分子上的SDS分子更难除去。在SDS-PAGE后，采用电印迹

2、(blotting)到PVDF膜上，也是常用的方法，因为PVDF膜结合蛋白质能力的专一性远远超过其结合盐、氨基酸和去垢剂，因此，蛋白质能和这些“污染物”分开。经过这样处理后，能用于BrCN化学裂解或酶解。二、HPLC纯化的样品如果样品是用反相HPLC纯化的，因为流动相是挥发性溶剂，它们在真空离心干燥或冻干样品时除去；如果蛋白质是用离子交换HPLC或疏水HPLC或凝胶过滤HPLC精制的，则样品要进行脱盐。脱盐或稀蛋白溶液的浓缩可用0.1％三氟乙酸(TFA)—乙腈(ACN)系统的短柱反相HPLC；也可采用一次性的Sek-Pak，因为蛋白质是水溶性的，所以先用能与水互溶的甲醇或乙腈(2m

3、l)润之，再用5ml纯水洗涤；然后样品液体通过Sep-Pak柱时，蛋白质保留在柱上，小分子的盐类流过柱体，用水溶液充分洗涤后，最后用甲醇或乙腈抽提蛋白质。小的超滤装置对浓缩蛋白质也是有效的。此外，有机溶剂或TCA沉淀也可以考虑。三、蛋白质样品中的二硫键和巯基(一SH)当蛋白质样品纯度达到要求，盐和小分子也除得比较“干净”，在进行酶解前，还要转变半胱氨酸残基成其他的稳定的衍生物。因为半胱氨酸的巯基在分肽过程中易自动氧化成各种产物，包括形成无序的二硫键，因此需要将半胱氨酸残基先转变成稳定的衍生物。常用有碘代乙酸烷化，因为这个反应是快速和专一的；同时这类试剂保存在暗处是很稳定的。而且，这

4、类试剂的矫作物(artifact)容易得到放射性标记物。蛋白质或肽在导入带电荷基团后也增加了其在水溶液中的溶解度。胱氨酸也可在还原后再修饰。1．还原和羧甲基化将1～20mg蛋白质溶解在含6mol/L盐酸胍的0.1mol/LTris-1mmol/LEDTA的缓冲液中，pH8.3，加DTT至2mmol/L或再多一些(过量于存在于蛋白质中的二硫键)，通氮气，然后迅速封闭，37℃反应1h，再加入50mmol/L的碘代乙酸(已用NaOH中和)，其量为1.1倍(分子比)过量于溶液中的巯基数(蛋白质中的一SH和DTT中的一SH总和),典型为4.5～5mmol/L，再次充氮气，于暗处37℃保温1h

5、。加2—巯基乙醇至最后浓度1％(V/V)结束反应，然后对50mmol/LNH4HC03，含0.01％硫二甘醇(thiodiglyc01)充分透析，冻干。注意：碘代乙酸必须是无色的，如果有碘存在，呈淡黄色，会引起巯基迅速氧化，阻碍了烷化反应，而且可能有副反应，使色氨酸修饰。碘代乙酰胺(iodoacetamide)也常代替碘代乙酸用于半胱氨酸残基的烷化。这常用于避免牛胱氨酸被导入负电荷，而用中性的碘代乙酰胺。另一种情况是变性剂不用盐酸胍，而用SDS，这时如果用碘代乙酸，反应往往进行得很慢，而且不完全，这是因为碘代乙酸的负电荷和蛋白质—SDS胶束(微团)上的负电荷相互排斥。2．还原和吡啶

6、乙烯化用4—乙烯吡啶(4-vinylpyridine)处理同上，通氮气保温过夜。第二节蛋白质的化学裂解裂解于甲硫氨酸(Met)溴化氰(BrCN)是首选的化学试剂，专一裂解在甲硫氨酸的羧基端，对多数蛋白质裂解效率为90％以上。BrCN在酸性条件下，裂解在甲硫氨酸的C端肽键上，将甲硫氨酸转化成高丝氨酸(Ⅱ)(homoserine)和高丝氨酸内酯(I)(homoserinelactone)的混合物，它们之间也能相互转化，如图2.1所示。对Met-Thr、Met-Ser键，则常常是低产率的，可能是β羟基产生下面的一系列反应(Ⅲ和Ⅳ)，最后形成高丝氨酸残基(V)，而未裂解此肽键，如图2.2所

7、示。Met-Cys键也不易裂解。典型的反应常常在20℃、70％甲酸(V/V)中进行24h，副反应是部分Asp-Pro键会断裂，一些酰胺基团会部分丢失，部分Asn-Gly会产生重排或环化，有时Trp会氧化。操作：蛋白质先用5％巯基乙醇在pH8.0室温下处理24h，加色胺(tryptamine)或色氨酸(以每分子甲硫氨酸加5分子色胺或色氨酸计算)以防止色氨酸氧化。蛋白质以1～5mg/ml浓度溶解在70％甲酸中，加入50倍过量，小体积的BrCN/70％甲酸，通氮并置于暗处，