骨桥蛋白激活NFκB通路调控OA软骨细胞MMP13与Ⅱ型胶原表达的实验研究

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1、中图分类号＆查丝：三UDC616．7博士学位论文学校代码!堕三三密级坌珏骨桥蛋白激活NF—KB通路调控OA软骨细胞MMP．13与II型胶原表达的实验研究OsteopontinRegulatestheExpressionofMMP一13andCOL2A1viaNF-KBPathwayinHumanOsteoarthritisChondrocytes作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：论文答辩日期兰必姜未临床医学骨科学湘雅医院雷光华教授答辩委员会主席当墨!堕中南大学2013年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成

2、果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：H,苴71：丑年￡月望日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网

3、络向社会公众提供信息服务。⋯名：盎翮签名研嘲驻血中南大学博士学位论文中文摘要摘要目的：研究骨桥蛋白(Osteopontin．OPN)在骨关节炎(Osteoarthritis，OA)中的调控作用，探讨其可能涉及的信号转导通路，并初步观察OPN对OA软骨细胞的功能学效应。方法：1、取13名非OA患者(8男5女，年龄53．14-12．8岁)和13名OA患者(6男7女，年龄68．8士7．9岁)的髋、膝关节软骨组织，Real—timeQPCR技术检测比较两组软骨标本中OPN及基质金属蛋白酶．13(matrixmetalloproteinase．13，MMP．13)基因表达水平，统计分析

4、OPN与MMP．13表达的相关性。II型胶原酶一步消化法处理OA软骨组织，分离培养OA软骨细胞并传代，取第一代OA软骨细胞继续培养，予以lug／ml浓度的OPN干预，分别采用Real．timeQPCR和WesternBlotting检测不同时间点(Oh，24h，48h，72h)MMP．13mRNA和蛋白的表达水平；然后以不同浓度的OPN(0，0．5，1，2，4ug／m1)干预OA软骨细胞，培养48h后再次观察MMP．13mRNA和蛋白表达水平的差异，确定细胞实验中OPN干预效用最强的最佳浓度及时间。2、取第一代OA软骨细胞继续培养，分为空白对照组和PDTC(Pyrrolidi

5、nedithiocarbamicacid，inhibitorofNF．1出)组，每组再分为Con．siRNA亚组、OPN．siRNA亚组、OPN亚组。免疫荧光技术检测各组NF．v．B(nuclearfactor-KappaB)p65核内外的表达情况，WesternBlotting检测各组NF—KBp65、p-NF-rd3p65、MMP一13、II型胶原的蛋白水平。3、构建、包装、制各OPN．shRNA慢病毒载体备用，取第一代OA软骨细胞，分为空白对照、Con．shRNA、OPN—shRNA、OPN四组，MTT和BrdU两种不同方法检测比较四组OA软骨细胞增殖能力的差异。结果：

6、湖南省博士科研创新项目(CX20118062)中南大学博士学位论文中文摘要1、与非OA患者比较，OA患者软骨组织中OPN及MMP一13基因均高表达(OPN0．848+0．068VS1．281+0．085，P=0．0010；^心口．13i0．971+0。081VS1．269-J：0．079，P=O．0091)，且软骨组织中舢．13的表达水平与OPN呈正相关(R2=0．761，P

7、其表达仍处于高水平俨=O．0001；P=0．0004)；不同浓度OPN干预软骨细胞48h后，MMP．13mRNA和蛋白的表达均增高，且1ug／ml浓度组增高最显著伊=0．007；P=-O．003)。、。2、OPN干预OA软骨细胞后，NF—r,Bp65核内移表现增加，OPN．siRNA转染细胞后核内移减少。OPN可显著上调NF．1(Bp65(P=-0．0027)、P—NF．r,Bp65(P=0。0021)、脚一13(P=-0．0079)的蛋白表达水平，并下调II型胶原表达水平(po．0188)；转染OPN