微囊藻毒素-LR对鱼类分子毒性效应的研究

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1、华中科技大学博士学位论文*摘要随着水体富营养化加剧，藻类所引起的水污染问题己越来越引起人们的关注，蓝藻是目前已知产生毒素最多、对人类健康造成的危害最大的藻类。微囊藻毒素-LR（microcystins-LR，MC-LR）是有毒蓝藻细胞合成的二级代谢产物，是一种细胞内毒素。微囊藻毒素可影响鱼类的胚胎发育和生长，也可引起肝脏、肾脏等内部器官的病理变化，和导致鱼体的氧化损伤等。然而，有关微囊藻毒素对鱼类分子水平上的毒性效应的研究则很少。本研究以斑马鱼和鳙鱼为对象，采用实时荧光定量PCR、分子克隆和免疫印迹技术在分子水平上揭示了MC-LR对鱼类的毒理效应。本研究中采用人工繁殖

2、的方法收集健康的斑马鱼胚胎，待孵化出膜后，用浓度为200μg/L和800μg/LMC-LR溶液浸泡幼鱼进行攻毒实验。在染毒12h，24h，48h，96h和168h后取样。用实时荧光定量PCR方法检测了斑马鱼幼鱼的重组激活基因Rag（Rag1，Rag2）、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶（LCK）、T细胞受体α（TCRα）、转录因子GATA1、锌指纹蛋白（Ikaros）和热休克蛋白基因（HSP90、HSP70、HSP60、HSP27）的表达变化。发现Rag1、Rag2、LCK、TCRα、GATA1和Ikaros都有表达上升趋势，特别是在800μg/LMC-LR处理后，在很多

3、时间点内表达上升明显，与对照组有显著差异（P<0.05）；热休克蛋白基因（HSP90、HSP70、HSP60、HSP27）的表达变化更为明显，在200μg/L和800μg/LMC-LR处理后，所有热休克蛋白基因的表达均有上升，且差异明显（P<0.05），尤其是HSP70在800μg/LMC-LR处理168h后，其表达量上升了近300倍。这说明MC-LR可影响斑马鱼幼鱼早期发育的重要调控因子、转录因子和热休克蛋白的表达，从而推测MC-LR可能影响斑马鱼的早期发育和免疫系统功能。本研究通过分子克隆技术中的RACE方法获得了两个鳙鱼去毒酶相关基因的cDNA全长，并进行了系统

4、进化分析及推导的蛋白质序列分析。谷胱甘肽过氧化物酶(GlutathionePeroxidase,GPX)基因cDNA全长903个核苷酸（nucleotides,nt）（GenBankaccessionno.FJ357422），包含426nt的开放阅读框，编码142个氨基酸，其中5′、3′端非编码区分别为182nt和292nt，推测GPX蛋白的分子式C740H1144N196O213S4，分子量为16.3226千道尔顿，等电点5.93，预测该蛋白为水溶性。系统进化分析和氨基酸序列比对的结果表明，鳙鱼GPX与草鱼、鲢鱼、I华中科技大学博士学位论文鲋鱼的相似性较高，分别为9

5、9.3%，97.9%，93.0%。谷胱甘肽还原酶(Glutathionereductase，GR)基因cDNA全长831个核苷酸（nucleotides,nt）（GenBankaccessionno.FJ349627），包含717nt的开放阅读框，编码239个氨基酸，其5′、3′端非编码区分别为74nt和40nt，推测GR蛋白的分子式C1131H1796N324O347S7，分子量为25.709千道尔顿，等电点7.71，预测该蛋白为水溶性。系统进化分析和氨基酸序列比对的结果表明，鳙鱼GR与斑马鱼、大西洋鲑相似性较高，分别为90.8%和81.1%。在健康鳙鱼中，对两个基

6、因转录和表达产物的器官组织分布进行了详细的分析。实时荧光定量PCR的结果表明，GPX和GR在所有被检测的鳙鱼组织中都有表达，呈组成型表达，且具有相似的组织分布模式，即在肝脏中的表达最高，其次是脾脏、鳃、中肾、头肾等，脑和心脏中的表达较低。分别构建GPX和GR基因的原核表达质粒pQE40-GPX和pQE40-GR，通过原核表达、表达蛋白纯化、并制备多克隆抗体，对脑、鳃、心脏、头肾、中肾、肝脏、肌肉、脾脏、和胸腺等器官中的目的基因蛋白进行免疫印迹分析。免疫印迹Westernblotting结果显示GPX蛋白在各个组织中广泛表达。经腹腔注射MC-LR（50μg/kgbody

7、weight）对鳙鱼进行染毒实验，以注射灭菌生理盐水作为对照，分别于染毒后6h，12h，24h，48h，96h和168h后取处理组和对照组的肝脏、脾脏、头肾、肠道。用实时荧光定量PCR方法检测鳙鱼的GPX和GR表达变化。发现在MC-LR诱导后GPX在肝脏、脾脏和头肾中过量表达，差异显著（P<0.05）；GR在肠道和头肾中，表达变化显著（P<0.05），上升倍数较高，而在肝脏和脾脏中GR的表达虽然也是增加的，但变化没有肠道和头肾中的明显。结果表明，GPX和GR基因在微囊藻毒素的影响下，转录及表达加强，生成更多的酶蛋白，从而增强机体对微囊藻毒素的解毒能力