掌叶大黄根腐病病原菌的分离与鉴定

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第２０卷第１期草业学报１９９－２０５Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ２０１１年２月掌叶大黄根腐病病原菌的分离与鉴定刘亚亚１，陈垣２，郭凤霞１，３，石有太１，李增轩１，李惠梅４（１．甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，甘肃兰州７３００７０；２．甘肃农业大学农学院，甘肃兰州７３００７０；３．甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州７３００７０；４．天祝县华藏林场金强林站，甘肃武威７３３０００）摘要：通过对甘肃礼县种植的二年生掌叶大黄根腐病发病部位分离纯化，然后利用根部离体接种法致病性测定，旨在明确导致掌叶大黄根腐病的病原物，为其防治提供理论依据。结果表明，从掌叶大黄根腐病株中共获得８种分离物，主要致病菌分别为粉红单端孢霉、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌，其分离频率随病原菌种类和植株发育进程而异，粉红单端孢霉和立枯丝核菌在不同生长期发病部位均可分离获得，分离频率分别为４１．１８％～５５．５６％和３．０３％～４４．４４％，尖孢镰刀菌仅在生长后期获得，分离频率为９．０９％。刺伤大黄幼根接种致病菌后，根腐病发病率均较无刺伤接种显著提高。尖孢镰刀菌潜育期最短，病斑面积最大，致病力最强，而粉红单端孢霉和立枯丝核菌潜育期长，病斑面积小，致病力相对较弱。以上说明伤口有助于掌叶大黄根腐病病原菌的侵染，建议掌叶大黄定植和栽培管理过程中要尽量保证植株的完整性，严防伤口产生。另外，利用根部离体接种法进行根腐病致病性测定操作简单，回接时间短，再分离率高，结果可靠，可在植物根部病害研究中应用。关键词：掌叶大黄根腐病；病原物；分离鉴定；致病性测定中图分类号：Ｓ４３５．１２１．４＋７；Ｓ５６７文献标识码：Ａ文章编号：１００４５７５９（２０１１）０１０１９９０７大黄是我国传统中药材。掌叶大黄（犚犺犲狌犿狆犪犾犿犪狋狌犿）与唐古特大黄（犚．狋犪狀犵狌狋犻犮狌犿）、药用大黄（犚．狅犳犳犻［１］犮犻狀犪犾犲）被药典规定为中药大黄的原植物，均以干燥的根及根茎入药。掌叶大黄主要化学成分为葡萄糖苷和苷元，主要有效成分苷元为蒽醌类衍生物，包括大黄酸（Ｒｈｅｉｎ）、大黄素（Ｅｍｏｄｉｎ）、大黄酚（Ｃｈｒｙｓｏｐｈａｎｏｌ）、芦荟大［２］黄素（Ａｌｏｅｅｍｏｄｉｎ）、大黄素甲醚（Ｐｈｙｓｃｉｏｎ）、番泻苷（Ｓｅｎｎｏｓｉｄｅ）、鞣质（Ｔａｎｎｉｎ）等，具有泻热攻下、行瘀化积、［３］［４］清火解毒消肿之功效。在我国，掌叶大黄主产于甘肃、青海、西藏、四川等地的高寒、高海拔地带，其中以甘肃礼县种植的掌叶大黄产量最高、质量最好，栽培历史悠久，成为“道地药材”，每年种植面积约２０００ｈｍ２［５］。［６，７］掌叶大黄主要以种子繁殖，其种子质量直接影响药材产量和质量。石有太等通过研究掌叶大黄籽粒灌浆特性和营养物质积累过程，提出掌叶大黄的最佳采收期，为其种子标准化采收提供了理论和技术依据。但近年来由于大黄根腐病发生普遍，对产量和品质造成极大的影响，成为制约大黄可持续发展的主要因素。对根腐病的［８］形成机理及其防治的研究成为大黄规范化生产中的重要内容。何凯对大黄根腐病初步研究表明，掌叶大黄根［９］［１０］腐病致病菌为镰刀菌属（犉狌狊犪狉犻狌犿），并分析了发病因素及其防治方法。何凯和李应东、潘水站等、王军［１１］［１２］等、金岳鹏相继从栽培技术及化学防治方面提出了大黄根腐病的综合防治措施，上述研究对了解大黄根腐病的发生与防治提供了一定的理论依据，但至今对掌叶大黄根腐病病原菌的系统研究尚未见报道，因此，对甘肃道地产区种植的掌叶大黄根腐病病原菌分离和致病性鉴定具有重要意义，可为大黄根腐病的有效防治提供理论和技术依据。１材料与方法１．１材料来源及准备病原菌分离和致病性测定用掌叶大黄分别为甘肃省礼县白关乡硬各坝村人工栽培的二年生和一年生植株。病原菌分离用掌叶大黄于２００７年４月２０日播种育苗，２００８年４月定植，定植株距３５ｃｍ，行距７０ｃｍ。于２００８收稿日期：２００９１１０９；改回日期：２００９１１２５基金项目：国家“十一五”科技支撑计划项目（２００７ＢＡＩ３７Ｂ０４，２００９ＺＸ０９３０８００２１）和甘肃省中药材产业科技攻关项目（ＧＹＣ０９０６）资助。作者简介：刘亚亚（１９８３），女，甘肃庆阳人，在读硕士。Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｙａｙａ５３４５３４＠１６３．ｃｏｍ通讯作者。Ｅｍａｉｌ：ｃｙｇｃｘ＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ ２００ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１）Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１年６月１６日、２００８年７月２４日、２００８年９月２３日分３批采样挖取后，筛选具有典型症状的根腐病病株带回实验室保存于４℃冰箱，待用于分离、鉴定和致病性测定。致病性测定用大黄苗为一年生掌叶大黄，于２００８年４月１５日播种育苗，２００８年９月２８日和１０月２２日分期小心挖取全苗，筛选健株带土用纸箱运回实验室备用。１．２病原菌的分离和纯化［１３］采用组织分离法切取不同时期采挖的发病典型的二年生掌叶大黄根腐病病株发病部位病健交界处组织，大小５ｍｍ×５ｍｍ，首先用７０％乙醇消毒５ｓ，０．１％ＨｇＣｌ表面消毒３０ｓ，灭菌水冲洗３～４次，然后在无菌条件２下分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅａｇａｒ，ＰＤＡ）上，培养２～３ｄ待产孢后进行纯化并初步［１４］鉴定到属。单孢分离纯化采用平板稀释画线分离法。１．３病原菌致病性测定［１５］采用离体根部接种法选取健康的一年生掌叶大黄幼根（根长８ｃｍ，直径０．７ｃｍ）为接菌材料，将上述大黄根腐病病株上分离纯化得到的病原物打成菌饼，分别做刺伤接菌和无刺伤接菌，以刺伤和无刺伤接ＰＤＡ培养基为对照，各处理中，每种分离物每个根上均匀接３个菌饼，每皿２根，３次重复，共１８个接种点。接菌后将其置于琼脂培养基上，根的两端用脱脂棉包裹起来，浇无菌水保湿。然后置（２５±１）℃恒温培养箱，保湿４８ｈ后观察记录发病情况，并于接菌后第８天统计发病率。待植株发病后，将发病部位再次进行分离培养，最后通过培养形状观察和普通显微镜镜检观察确定分离得到的病原菌与初接病原菌是否为同一病菌。将致病菌单孢分离后在ＰＤＡ上黑暗培养１０ｄ，观察病原菌培养性状及色泽，并挑取一定量的菌落在兰州大学电镜室利用扫描电镜（ＧＳＭ１３８，日本）观测菌丝、孢子囊和卵孢子等的有无、形态、大小，并进行显微照相。１．４致病菌形态学观察［１６］将经过致病性测定所确定的致病病原菌接种在ＰＤＡ培养基上，于（２５±１）℃恒温培养箱中黑暗培养７ｄ，观察菌落颜色、形状、大小和产孢情况，若产孢则继续观察分生孢子颜色、形态及分生孢子梗形态，测量其大小，并［１７，１８］由甘肃农业大学草业学院植物病理学实验室鉴定到种。２结果与分析２．１大黄根腐病田间症状田间观察表明，大黄根腐病主要发生在移栽定植当年的５－６月，发病初期，根部出现湿润性形状不规则和大小不等的黑褐色病斑，严重时病斑不断扩大，深入根茎内部，使局部或全部组织呈水渍状腐烂变黑，与健康组织分界明显，易从病健交界处剥离。一般发病较轻的幼苗地上部分无明显症状，当年移栽定植后对成活率影响不大，但发病重的幼苗生长势弱，幼苗移栽定植后，造成根茎腐烂，严重时全株萎蔫死亡，成活率很低。２．２大黄根腐病病原菌分离经对二年生掌叶大黄不同生长时期根腐病病株发病部位进行分离和纯化，结果表明（表１），从掌叶大黄根腐病株发病部位获得的分离物种类及其分离频率随植株生长发育时期的不同而异，随着植株的生长发育，分离物种类和数量增多，多态性增强。３次分离结果共获得８种分离物，根据培养性状和形态特征初步将其鉴定到属，分别为粉红单端孢霉、立枯丝核菌、根霉属、未鉴定菌ａ、镰刀菌、青霉属、尖孢镰刀菌和未鉴定菌ｂ。其中粉红单端孢霉分离频率最高，与其他分离物分离频率间的差异均达到极显著水平（犘＜０．０１），其次为立枯丝核菌和根霉属。根霉属分离频率随大黄生长发育时期的不同差异较大，生长盛期未分离到根霉属，而在返青期和生长后期均可不同程度分离获得根霉属。６月（返青后）根腐病发病部位分离物及其分离频率从高到低依次为粉红单端孢霉、根霉属和立枯丝核菌；７月（生长盛期）仅分离出粉红单端孢霉和立枯丝核菌２种菌，而９月（生长盛期）分离获得８种菌，不同生长期３次分离培养结果均得到粉红单端孢霉和立枯丝核菌。２．３大黄根腐病病原物致病性测定通过无刺伤和刺伤接种进行了掌叶大黄根腐病病原菌致病性测定，结果表明（表２），刺伤与无刺伤接种ＰＤＡ培养基（对照）后均不发病，但接种粉红单端孢霉、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌和根霉属均可产生病斑，并与大黄根腐病症状相似，从接种后根部显症位点上均能够再次分离得到先前接入的同种病菌，符合柯赫氏法则，说明以上４种菌均为掌叶大黄根腐病的致病菌，其余分离物均为根腐病非致病菌。其中，２种方法接种立枯丝核菌、根霉属 第２０卷第１期草业学报２０１１年２０１和尖孢镰刀菌均能使掌叶大黄幼根发病，其中刺伤接种发病程度更为严重。刺伤、无刺伤接种尖孢镰刀菌后第２天开始显示症状，病斑面积均逐渐扩大，但发病率出现差异，第８天刺伤处理发病率较无刺伤发病率高５０％，经狋检验两者差异性达到极显著水平（犘＜０．０１）。接种尖孢镰刀菌后产生病斑面积较大，表现为圆形或近圆形黑褐色湿润性病斑，贴菌饼处有明显的凹陷，菌饼周围无凹陷，病斑面积随接种时间的延长而扩大，且在接菌部位尖孢镰刀菌菌丝生长茂密。刺伤、无刺伤接种立枯丝核菌和黑根霉后第４天均开始显示症状，第８天刺伤接菌发病率较无刺伤接菌发病率分别高６１．１％和１１．１％，病斑均较尖孢镰刀菌小。接种立枯丝核菌，病斑面积较大，为圆形或近圆形黑褐色病斑，贴菌饼处有明显的凹陷，部分腐烂裂开，菌饼周围无凹陷，呈黑褐色病斑向周围扩展。还可明显观察到所接立枯丝核菌菌丝的伸长生长。无刺伤接种粉红单端孢霉后幼根始终没有病斑产生，而刺伤接种该病菌后第４天出现病斑，显示根腐病症状，第８天发病率达１００％，发病部位病斑面积小，圆形或近圆形黄褐色病斑，病斑平整无凹陷，表面无霉层，其对掌叶大黄幼根伤口处侵染性强但致病力较弱。结合分离频率与致病性测定结果，本研究将粉红单端孢霉、立枯丝核菌、尖孢镰刀菌确定为大黄根腐病的主要致病菌。表１掌叶大黄根腐病病株病原物分离犜犪犫犾犲１犐狊狅犾犪狋犲犱狉犲狊狌犾狋狅犳狋犺犲狆犪狋犺狅犵犲狀狊犳狉狅犿狋犺犲狉狅狅狋狉狅狋犱犻狊犲犪狊犲狆犾犪狀狋狊狅犳犚．狆犪犾犿犪狋狌犿％分离物不同时期分离频率Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔａｇｅｓ３批分离频率Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｕｎｇｕｓ６月１６日Ｊｕｎｅ１６７月２４日Ｊｕｌｙ２４９月２３日Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ２３Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｆｒｅｑｕｅｎｃｙ粉红单端孢霉犜犺犻犮犺狅狋犺犲犮犻狌犿狉狅狊犲狌犿４１．１８５５．５６４２．４２４６．３９ａＡ立枯丝核菌犚犺犻狕狅狋狅狀犻犪狊狅犾犪狀犻２３．５３４４．４４３．０３２３．６７ｂＡＢ根霉属犚犺犻狕狅狆狌狊３５．２９０．００１２．１２１５．８０ｂｃＢ尖孢镰刀菌犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｓｃｈｌｅｃｈｔ．０．０００．００９．０９３．０３ｂｃＢ青霉属犘犲狀犻犮犻犾犾犻狌犿０．０００．００６．０６２．０２ｃＢ镰刀菌犉狌狊犪狉犻狌犿ｓｐ．０．０００．００３．０３１．０１ｃＢ未鉴定菌ａＮｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａ０．０００．００２１．２１７．０７ｂｃＢ未鉴定菌ｂＮｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂ０．０００．００３．０３１．０１ｃＢ总计Ｔｏｔａｌ１００．００１００．００１００．００１００．００注：表中同列不同小写字母表示在犘≤０．０５差异显著；不同大写字母表示在犘≤０．０１差异显著。Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｍａｌｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｍｅａｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｔ犘≤０．０５；Ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃａｐｉｔａｌｌｅｔｔｅｒｓｉｎｔｈｅｓａｍｅｃｏｌｕｍｎｍｅａｎｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｔ犘≤０．０１．２．４掌叶大黄根腐病病原菌鉴定从二年生掌叶大黄根腐病植株上分离的粉红单端孢霉在ＰＤＡ培养基上生长较慢，培养１３～１４ｄ才能长满全皿（９０ｍｍ），菌丝较浓密，黑暗条件下始终为白色绒毛状，但在光照条件下初为白色绒毛状，后逐渐转变为粉红色粉末状霉。扫描电镜结果（图１）显示，粉红单端孢霉分生孢子梗直立、无分枝、细长无隔膜，分生孢子顶生，卵圆形，大小为３～７。μｍ×２～３μｍ立枯丝核菌在ＰＤＡ培养基上生长速度较快，培养３～４ｄ就能长满全皿（９０ｍｍ），菌丝较稀疏，初为白色绒毛状，后逐渐变为褐色，呈辐射状向四周伸展，产生大小不一的菌核。图１显示立枯丝核菌不产生孢子，菌丝呈近直角分枝，分枝处有明显溢缩现象，不远处有隔膜，菌丝较粗，直径为４～１０。μｍ尖孢镰刀菌在ＰＤＡ培养基上培养６～７ｄ可长满全皿（９０ｍｍ），初生菌丝白色绒毛状，以后由中间开始逐渐变为紫红色。图２显示尖孢镰刀菌分生孢子梗短、不分枝、产生于菌丝侧面，小型分生孢子较多，着生于单生瓶梗上，卵形或肾形０～１隔，４～７；大型分生孢子较少，镰刀形，两端渐细，具钩状，多数为３隔，大小为μｍ×１～３μｍ９～１３μｍ×２～３μｍ产孢梗较短，单瓶枝。 ２０２ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１）Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１表２掌叶大黄根腐病病株分离病原物致病性测定结果犜犪犫犾犲２犜犺犲狉犲狊狌犾狋狅犳狆犪狋犺狅犵犲狀犻犮犻狋狔狋犲狊狋狊犫狔狋犺犲犳狌狀犵犻犻狊狅犾犪狋犲犱犳狉狅犿狋犺犲犚．狆犪犾犿犪狋狌犿狉狅狅狋狉狅狋狆犾犪狀狋狊接种病菌无刺伤接种Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｓ刺伤接种Ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｓ不同接种差异性狋检验狋ｔｅｓｔｉｎＩｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｂｙｎｏｎｇｏｒｅｒａｄｉｃｌｅｓｂｙｇｏｒｅｒａｄｉｃｌｅｓｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓｐａｔｈｏｇｅｎｓ接种位点数病斑数病斑率接种位点数病斑数病斑率病斑数病斑率ＩｎｏｃｕｌａｔｉｏｎＤｉｓｅａｓｅＴｈｅｄｉｓｅａｓｅｓｐｏｔＩｎｏｃｕｌａｔｉｏｎＤｉｓｅａｓｅＴｈｅｄｉｓｅａｓｅｓｐｏｔＤｉｓｅａｓｅＴｈｅｄｉｓｅａｓｅｓｐｏｔｌｏｃａｔｉｏｎｓｓｐｏｔｓｒａｔｅｓ（％）ｌｏｃａｔｉｏｎｓｓｐｏｔｓｒａｔｅｓ（％）ｓｐｏｔｓｒａｔｅｓ（％）粉红单端孢霉犜．狉狅狊犲狌犿１８００．０１８１８１００．０１８．０１００．０立枯丝核菌犚．狊狅犾犪狀犻１８４２２．２１８１５８３．３１１．０ｎｓ６１．１ｎｓ根霉属犚犺犻狕狅狆狌狊１８１５．６１８３１６．６２．０ｎｓ１１．０ｎｓ尖孢镰刀菌１８９５０．０１８１８１００．０９．０５０．０犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿ｓｃｈｌｅｃｈｔ．青霉属犘犲狀犻犮犻犾犾犻狌犿１８００．０１８００．００ｎｓ０．０ｎｓ镰刀菌犉狌狊犪狉犻狌犿ｓｐ．１８００．０１８００．００ｎｓ０．０ｎｓ未鉴定菌ａＮｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａ１８００．０１８００．００ｎｓ０．０ｎｓ未鉴定菌ｂＮｏｎｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂ１８００．０１８００．００ｎｓ０．０ｎｓ对照（ＰＤＡ培养基）１８００．０１８００．００ｎｓ０．０ｎｓＣＫ（ＰＤＡｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍ）注：表示在犘≤０．０５差异显著；表示在犘≤０．０１差异极显著；ｎｓ表示差异不显著。Ｎｏｔｅ：ｍｅａｎｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｔ犘≤０．０５；ｍｅａｎｓｇｒｅａｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｔ犘≤０．０１；ｎｓｍｅａｎｓｎｏｎｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ．图１粉红单端孢霉菌丝、分生孢子梗（左图）和立枯丝核菌菌丝（右图）（电镜扫描照片）犉犻犵．１犜犺犲犿狔犮犲犾犻狌犿，犮狅狀犻犱犻狅狊狆狅狉犲狆犲犱狌狀犮犾犲狅犳犜．狉狅狊犲狌犿（犾犲犳狋）犪狀犱犿狔犮犲犾犻狌犿狅犳犚．狊狅犾犪狀犻（狉犻犵犺狋）（狆犻犮狋狌狉犲狊狅犳犲犾犲犮狋狉狅狀犿犻犮狉狅狊犮狅狆犲）３讨论与结论作物根腐病往往由多种病菌混合侵染造成，不同地区或同一地区不同年份因生态条件不同其优势菌种类有［１９］［２０］［２１］［２２］可能不同。根腐病在豌豆（犘犻狊狌犿狊犪狋犻狌犿）、葡萄树（ｇｒａｐｅｖｉｎｅｓ）和欧洲赤松（犘犻狀狌狊狊狔犾狏犲狊狋狉犻狊）上均普［２３］遍发生。病原真菌有不同的寄主范围，其致病力因寄主而异，即真菌的致病性取决于寄主－真菌的组合，立枯丝核菌是广泛分布于全世界的一种土壤习居菌。它不但侵染范围广，常引起多种植物的病害，而且在土壤中的腐［２４］生竞争能力强，存活时间长，因此被认为是最具破坏力的土传植物病原物之一。尖孢镰刀菌、立枯丝核菌可导［２５］［２６］［２７］致豌豆、白术（犃狋狉犪犮狋狔犾狅犱犲狊犿犪犮狉狅犮犲狆犺犪犾犪）、草坪草（ｔｕｒｆｇｒａｓｓ）等根腐病的发生。大量研究表明，粉红单端孢霉为弱势寄生菌，主要导致蔬菜瓜果红粉病，尤其是苹果黑点病、红点病等，它本身不能直接侵染发病，而［２８］［８］当果实表面造成伤口或产生腐生组织时才能侵染发病。何凯发现，大黄根腐病主要由镰刀菌引起，常在收获当年或前一年发生，但主要发生在当年春季移栽定植的幼苗上，发病部位主要在根下部和中部。本研究观察发 第２０卷第１期草业学报２０１１年２０３图２尖孢镰刀菌分生孢子梗（上）和菌丝（下）（电镜扫描照片）犉犻犵．２犜犺犲犮狅狀犻犱犻狅狊狆狅狉犲狆犲犱狌狀犮犾犲（犪犫狅狏犲）犪狀犱犿狔犮犲犾犻狌犿（犫犲犾狅狑）狅犳犉．狅狓狔狊狆狅狉狌犿（狆犻犮狋狌狉犲狊狅犳犲犾犲犮狋狉狅狀犿犻犮狉狅狊犮狅狆犲）现，甘肃礼县种植的二年生掌叶大黄发病初期根部出现湿润性形状不规则和大小不等的黑褐色病斑，严重时病斑不断扩大，深入根茎内部，使局部或全部组织呈水渍状腐烂变黑，与健康组织分界明显、易剥离。发病轻时地上部分无明显症状，严重时全株萎蔫死亡。经组织分离法分离培养，在根腐病发病株中分离并鉴定出８种分离物，致病性测定揭示，根腐病主要致病菌分别为粉红单端孢霉、尖孢镰刀菌和立枯丝核菌。其分离频率随病原菌种类和植株发育进程而异，粉红单端孢霉和立枯丝核菌在不同生长期发病部位均可分离获得，分离频率为４１．１８％～５５．５６％和３．０３％～４４．４４％，尖孢镰刀菌仅在生长后期获得，分离频率为９．０９％。刺伤大黄幼根接种致病菌后，根腐病发病率均较无刺伤接种显著提高。尖孢镰刀菌潜育期最短，形成的病斑面积最大，致病力最强，而粉红单端孢霉和立枯丝核菌潜育期长，形成的病斑面积小，致病力相对较弱。以上说明伤口有助于掌叶大黄根腐病病原菌的侵染，即大黄根腐病菌主要通过伤口侵染传播。掌叶大黄定植返青后，粉红单端孢霉、立枯丝核菌等可能首先侵染根部表皮，产生病斑进一步形成伤口，为致病力强的尖孢镰刀菌等侵染创造条件，最终发生混合侵染。建议在掌叶大黄规范化生产中，定植和栽培管理过程中要尽量保证植株的完整性，严防产生伤口为致病菌侵染创造［２９］有利条件，这也为刘海元总结的大黄种植技术措施提供了一定的理论依据，即在大黄定植移栽时要尽量避免造成伤口，在定植移栽当年摘除花茎管理操作过程中，要及时用土盖住根头部分并踩实以防切口进水。 ２０４ＡＣＴＡＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥＳＩＮＩＣＡ（２０１１）Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１［３０］另外，本研究中采用的离体根部接种法是针对根部病害的特殊性，将离体接种法与根段回接法结合起来并加以改进，用于致病性测定，该法比较直观，便于观察病症开始出现的时间，进而可从潜育期与发病率两方面了解分离物致病力的强弱和致病性的有无，但此方法必须在无菌条件下进行，培养条件可控性较强，技术操作简单，可大大缩短回接时间，且再分离率高，极大提高了根部病害病原菌回接研究的准确性和研究效率，在植物根部病害研究中具有较广泛的应用前景。致谢：甘肃农业大学草业学院植物保护系王生荣教授在病原菌鉴定中给予指导。甘肃省礼县林业局林榜成和甘肃农业大学２００９～２０１０届本科生陈蕾蕾、汪启龙、范琪、周俊、陈魏洁、孙春丽和张娥参与田间试验。参考文献：［１］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［Ｓ］．北京：化学工业出版社，２００５．［２］张贵君．现代实用中药鉴别技术（第一版）［Ｍ］．北京：人民卫生出版社，２０００：３６．［３］李家实．中药鉴定学［Ｍ］．上海：上海科技出版社，１９９６：５５５８．［４］李斌常，何凯，张三元．掌叶大黄生物学特性的研究［Ｊ］．中药材，１９９２，１５（８）：８１０．［５］李应东，何凯，柴兆祥，等．掌叶大黄规范化种植技术及其主要病虫害防治［Ｊ］．世界科学技术－中医药现代化－中药材栽培研究，２００５，７（２）：７４７６．［６］石有太，陈垣，郭凤霞，等．掌叶大黄种子灌浆动态及其发芽特性研究［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（３）：１７８１８３．［７］石有太，陈垣，郭凤霞，等．掌叶大黄籽粒营养物质积累动态及其发芽特性研究［Ｊ］．中国中药杂志，２００９，３４（１５）：１９７９１９８３．［８］何凯．掌叶大黄根腐病的发生与防治［Ｊ］．甘肃农业科技，１９９４，５：３４．［９］何凯，李应东．掌叶大黄主要病虫鼠害及防治［Ｊ］．中国中药杂志，２００２，２７（８）：６２０６２１．［１０］潘水站，张杰，张鹏，等．陇南地区大黄无公害栽培技术［Ｊ］．甘肃农业科技，２００４，６：５４５５．［１１］王军，田婧，邢作山，等．大黄的种植与加工留种技术［Ｊ］．甘肃农业科技，２００４，２：４１．［１２］金岳鹏．大黄栽培技术［Ｊ］．实用技术，２００７，１２：４８．［１３］谢昌平，谭翰杰，张能，等．斐济金粽叶斑病菌鉴定及生物学特性［Ｊ］．植物保护，２００９，３５（２）：６７７１．［１４］张昊，张争，许景升，等．一种简单快速的赤霉病菌单孢分离方法———平板稀释画线分离法［Ｊ］．植物保护，２００８，３４（６）：１３４１３６．［１５］阎合，徐秉良，梁巧兰，等．甘草叶斑病的发生与病原菌鉴定［Ｊ］．植物保护，２００９，３５（３）：１１１１１４．［１６］古丽君，徐秉良，梁巧兰，等．兰州市草坪禾草根腐病的发生及病原菌鉴定［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（４）：１７５１８０．［１７］魏景超．真菌鉴定手册［Ｍ］．上海：上海科学出版社，１９７９．［１８］戴芳澜．中国真菌总汇［Ｍ］．北京：科学出版社，１９７９．［１９］孙文姬，简桂良，刘秀兰，等．山东菏泽地区牡丹根腐病病原真菌的分离鉴定［Ｊ］．植物病理学报，１９９９，２９（２）：１７７１８０．［２０］ＡｋａｍａｔｓｕＨＯ，ＧｒüｎｗａｌｄＮＪ，ＣｈｉｌｖｅｒｓＭＩ，犲狋犪犾．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｏｄｏｍｉｎａｎｔｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔ，ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄａｍｐｌｉｆｉｅｄｒｅｇｉｏｎｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｔｈｅｐｅａｒｏｏｔｒｏｔｐａｔｈｏｇｅｎ，犃狆犺犪狀狅犿狔犮犲狊犲狌狋犲犻犮犺犲狊［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，２００７，７１：８２８６．［２１］ＰｅｒｔｏｔａＩ，ＧｏｂｂｉｎａＤ，ＬｕｃａＦＤ，犲狋犪犾．ＭｅｔｈｏｄｓｏｆａｓｓｅｓｓｉｎｇｔｈｅｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆＡｒｍｉｌｌａｒｉａｒｏｏｔｒｏｔａｃｒｏｓｓｖｉｔｉｃｕｌｔｕｒａｌａｒｅａｓａｎｄｔｈｅｐａｔｈｏｇｅｎ’ｓｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｓｐａｔｉａｌｔｅｍｐｏｒａｌｐａｔｔｅｒｎｉｎｎｏｒｔｈｅｒｎＩｔａｌｙ［Ｊ］．ＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，２００８，２７：１０６１１０７０．［２２］ＡｓｉｅｇｂｕＦＯ，ＮａｈａｌｋｏｖａＪ，ＬｉＧ．ＰａｔｈｏｇｅｎｉｎｄｕｃｉｂｌｅｃＤＮＡｓｆｒｏｍｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｏｏｔｒｏｔｆｕｎｇｕｓ犎犲狋犲狉狅犫犪狊犻犱犻狅狀犪狀狀狅狊狌犿ｗｉｔｈＳｃｏｔｓｐｉｎｅ（犘犻狀狌狊狊狔犾狏犲狊狋狉犻狊Ｌ．）［Ｊ］．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，１６８：３６５３７２．［２３］侯金伟，南志标．植物病原真菌对土壤种子库的影响［Ｊ］．草业学报，２００９，１８（４）：２４１２５０．［２４］李克梅，郭庆元，赵莉，等．新疆苜蓿立枯丝核菌菌丝融合群及其致病性研究［Ｊ］．草业科学，２００９，２６（５）：１５１１５４．［２５］陈庆河，翁启勇，何玉仙，等．福建省豌豆根腐病病原及致病性研究［Ｊ］．福建农业学报，２００４，１９（１）：２８３１．［２６］臧少先，安信伯，石丽军，等．白术根腐病症状类型及病原鉴定［Ｊ］．河北农业大学学报，２００５，２８（３）：７３７６．［２７］石洁，李建成，刘玉瑛，等．草坪草根腐病病原菌研究初报［Ｊ］．华北农学报，２０００，１５（增刊）：９４９８． 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