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1、基因工程实验设计题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达专业：生工1001姓名：刘会淼2013年3月13实验目的：研究绿色荧光蛋白（GreedFluorescentProtein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。实验方法;通过分别将DH-5α(pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coliDH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸内切酶NotI与BamH1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后,通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（
2、GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21内进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。1.材料与方法：1.1.1实验材料克隆菌E.coliDH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒pET-28a和pEGFP-N3，引物，限制性内切酶BamH1、NotⅠ1.1.2仪器设备Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系
3、统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管1.1.3试剂及溶液分装后于121℃高压灭菌20min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1%）；溶液Ⅰ50mL葡萄糖50mmol/LTris-Cl(pH8.0)25mmol/LEDTA(pH8.0)10mmol/L121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存；溶液Ⅱ100mLNaOH0.2mol/LSDS1%(W/V)用时由母液2mol/LNaOH、10%(W/V)SDS稀释现配；溶液Ⅲ100mLKOAc(5mol/L)60mL冰乙酸
4、11.5mLH2O28.5mL121℃高压灭菌15min后置于0~4℃贮存；氯仿；琼脂糖；灭菌的去离子水；10×酶切缓冲液；TaqDNA聚合酶；TaqDNA聚合酶缓冲。灭菌的0.1mol/LCaCl2，标准相对分子质量的DNA；溴乙锭（EB）储存液0.5µg/mL；LB/Kan（50µg/mL）固体培养基；IPTG配成浓度为400mM水溶液，-20℃保存备用；卡那霉素（Kan）配成浓度为100ug/mL水溶液，-20℃保存备用；70%乙醇：用新开装的乙醇和灭菌无离子水配成，放在0~4℃；无水乙醇：放在0~4℃；RNase母
5、液：将RNase溶于10mmol/LTris·Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl配成的试剂中，配成10mg/mL的溶液，在100℃加热15min，使可能溶有的DNase失活，然后缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃；1.2方法：1.2.1大肠杆菌DH-5α(pEGFP-N3)染色体DNA的提取1.2.2、实验目的：掌握酚氯仿法提取ＤＮＡ的原理和操作。1.2.3，器材：⑴，微量移液器、高速离心机、1.5mlＥＰ管、吸头、烘箱、水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱⑵，消化缓冲液:CTAB/NaCl溶液：4.1g
6、 NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml；其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。1.2.4实验原理生物的大部分或几乎全部ＤＮＡ都集中在细胞核或类核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯仿对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经苯酚、氯仿抽提后
7、，蛋白质变性而被离心沉降到酚相与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的RNase去除RNA污染。1.2.5、实验步骤1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 4. 加1.5ml
8、 CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 7、加 1/10 体积3mol/L NaAc，及２.５ 倍体积预
