淋巴细胞培养与分离

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1、淋巴细胞的分离与培养杨星淋巴细胞的分离人淋巴细胞的方便来源是外周血，分离的原则是收率较高、纯度较好、失活较低。根据不同试验有相对纯度，无论采用哪种方法，应尽最大可能保持细胞应有活性。分离的技术可由细胞的物理性状和表面标志设计，根据不同实验目的可采用密度梯度离心法、吸附分离法和其它特殊分离法。外周血红细胞粒细胞单个核细胞血小板淋巴细胞单核细胞1.0931.030~1.0351.075~1.090Ficoll：1.077±0.0011.092密度分类（PBMC）密度梯度离心法原理：外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群

2、按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。（一）Ficoll分层液法Ficoll为合成性蔗糖聚合物的商品名，无毒，但高浓度溶液往往不等渗，且粘性高，易使细胞聚集。组成：2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份泛影葡胺生理盐水Ficoll分层液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳。别名：淋巴细胞

3、分离液实验方法1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）3.20℃，1500r/min，离心30min1500rpm,20℃,30minPBMC红细胞、粒细胞稀释的血浆、血小板FicollFicoll4.沿管壁周缘轻轻吸取PBMC层移入另一试管中。5.加足量稀释液充分洗涤，1800r/min离心10min，弃上清。6.重复洗涤一次，1400r/min离心10min，弃上清。7.适量的培养基重悬细胞，计数。分离单个核细胞纯度为95%。淋巴细胞约占90%～95%。（二）Percoll分层

4、液法1、一种连续密度梯度离心分离法。2、主要成分：硅胶颗粒，其大小不一，经高速离心后形成连续密度梯度。PBMC悬液主要含淋巴细胞，但一般还混杂有数量不等的单核细胞及少量粒细胞、红细胞和血小板。那么怎样获得高纯度的淋巴细胞及其亚群呢？淋巴细胞及其亚群的分离(一)红细胞的去除一般采用无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。(二)血小板的去除将PBMC悬液通过离心洗涤2～3次，常可去除PBMC中绝大部分混杂的血小板。在某些疾病状态下，若外周血中血小板数量异常增多，可采用胎牛血清(FCS)梯度离心法去除PBMC中混杂的血小板。(三)单核细胞和粒细胞的去除1．粘附去除法原理：单核

5、细胞和粒细胞在37℃和Ca离子存在条件下能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶。采集的非粘附细胞即为淋巴细胞。优点：简便易行，对细胞损伤极少。缺点：B细胞也有较弱的粘附能力，因此有部分B细胞丢失。该法去除单核细胞后，大约95%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。2．羰基铁粉吞噬法原理：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力，吞噬羰基铁粉后的单核细胞密度增大。方法一：经聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心后，则单核细胞沉积于管底而被去除。方法二：用磁铁将细胞吸至管底，上层液中即含较纯的淋巴细胞。3．苯丙氨酸甲酯去除法❈原理：苯丙氨酸甲酯(PME)具有亲溶酶体性质，能渗入

6、细胞溶酶体内被水解为游离氨基酸，导致溶酶体内因渗透压改变而破裂，释放出的酶类物质可引起细胞溶解。❈用该法可溶解含溶酶体的细胞，如单核细胞、粒细胞和成纤维母细胞等，B细胞和大多数T细胞因缺乏溶酶体酶，因而不受影响。❈该法去除单核细胞后，约99%的单个核细胞为淋巴细胞，活性大于95%。（四）、淋巴细胞亚群的分离原理：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。常用方法：（1）E花环分离法（2）尼龙纤维分离法（3）流式细胞术（4）磁珠分离术（5）亲和板结合分离法(1)E花环分离法原理：人类T细胞表面上有能与绵羊红细胞相结合的受体（E受体，CD2）,能与经溴化二氨基异硫基异硫脲氰化

7、物（AET）处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的、细胞体积和比重较大的E花环。方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加入分层液→T细胞形成E花环而沉于管底→悬液中为B细胞。E花环（2）尼龙纤维分离法原理：B细胞在37℃时易粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维上，而T细胞不具此能力。方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管→洗脱下来的是T细胞。（3）流式细胞术又叫荧光激活细胞分离仪(nuorescenceactivatedcellsorter,FACS)法原理：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定