蛋白质免疫印迹技术

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1、实验二蛋白质免疫印迹技术一、免疫学研究抗原物质的结构和功能；免疫应答产物的结构和功能；抗原刺激机体产生免疫应答的规律。免疫学的研究范围很广，与很多相关学科交织在一起，并且发展成了很多学科，如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。随着免疫生物学的发展，人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构（即免疫系统）。淋巴组织免疫活性细胞免疫活性介质免疫系统功能的生理和病理表现功能名称生理功能病理表现免疫防御清除病原微生物及其它抗原性异物超敏反应（强）免疫缺陷病（弱）免疫自稳清除损伤或衰老细胞自身免疫性疾

2、病免疫监视清除突变或畸变细胞防止肿瘤发生肿瘤或病毒持续性杀伤病毒感染细胞感染当外源异体物质，如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后，可以激活机体免疫系统，产生对外源物质的排除作用，从而保护机体免受外源物质的侵害。机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。免疫应答的类型（一）固有性免疫应答（innateimmuneresponse)又称先天性免疫应答，非特异性免疫应答：是机体在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。（二）适应性免疫应答（adaptiveimmuneresponse）又称获得性免疫应答，特异

3、性免疫应答，是机体出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。（具有特异性、多样性、记忆性、耐受性、自限性）抗原和免疫原性抗原（antigens，Ag）是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞，并在体内或体外发生特异性反应的物质。常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。抗原具有两方面的特性：免疫原性（immunogenicity）和免疫反应性（immunoreactivity）。免疫原性（immunogenicity）是指抗原刺激机体引起免疫应答的能力。免疫反应性（i

4、mmunoreactivity）是指抗原与相应免疫应答产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。抗原的分类抗原可以分为完全抗原和半抗原。完全抗原：具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原（completeantigen）半抗原：只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原（hapten），也称为不完全抗原(incompleteantigen)。与蛋白质结合后成为完全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂都属于半抗原。抗体的种类抗体（antibodies，Ab)

5、是专门对抗抗原特异结构的球蛋白，故也称为免疫球蛋白（immunoglobulins,Ig)。存在于血清、体液中，是构成机体免疫作用的主要物质。免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同，分为五种类型：IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。人体血清中IgG含量最多，IgA次之，IgM较少，IgD和IgE微量。抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内（invivo），也可发生于体外（invitro）。体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒

6、素等作用；体外反应：可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。因抗体主要存在于血清中，在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验，所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应（serologicreaction）。二、印迹法（blotting）印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。人们用类似的方法，对RNA和

7、蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法三、蛋白免疫印迹的应用免疫印迹法(immunoblottingtest,IBT)，亦称酶联免疫电转移印斑法(enzymelinkedimmunoelectrotransferblot,EITB是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方

8、法。蛋白质免疫印迹检测技术一、实验目的二、实验原理三、实验仪器四、操作步骤五、实验结果与分析六、思考题一、实验目的学习掌握动物抗血清的制备原理及技术通过实际操作学会动物抗血清的制备掌握Western－blotting的基本原理熟悉Western－blotting的实验操作二、实验原理第一部分动物的常规免疫及抗血清的制备第二部分Western－blotting