产脂肪酶真菌的筛选

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1、脂肪酶产生细菌的筛选巩素绢（河北农业大学生命科学学院微生物与生化药学，河北保定071001）摘要：从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌，以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料。本试验从保定市炼油厂附近土样中，经富集培养、平板筛选得到22株脂肪酶产生菌株，通过复筛得到1株脂肪酶活力较高真菌。为脂肪酶产生菌以及脂肪酶的工业化生产与应用奠定了基础。关键词：脂肪酶；筛选；真菌Abstract：Thestudyaimedtoseekforthefungiwithhighyieldoflipasefromthegreasysoil，soastoprov

2、idethematerialforexpandingthefungisourceoflipase.22strainsoffungiproducinglipasewereisolatedbyenrichmentcultureandflatscreeningmethodsinsoilsamplescollectedfromtherefineryofBaoding．Astainwithhigheractivityofproducinglipasewasisolatedbyre-screeningmethods.Thestudylaidafo

3、undationforlipaseproducingbacteriaandindustrialproductionandapplicationoflipasetosomeextent．Keywords:Lipase;Screening;fungi前言脂肪酶(Lipase，E.C.3.1.1.3，甘油三酯水解酶)，可在油水界面催化甘油三酯形成甘油二酯、甘油单酯或甘油及游离脂肪酸［1］。微生物脂肪酶比动物脂肪酶酶解作用的pH和温度范围更宽，便于工业化生产获得高纯度酶制剂［2］。脂肪酶在微生物界分布很广，据不完全统计，目前已有65个属的微生

4、物能够产生脂肪酶［3］。随着对微生物脂肪酶研究的深入，已发现多种具有不同的酶学性质和底物特异性的微生物脂肪酶，其在水解、酯化、转酯及酯类手性合成等反应中都表现出较好的应用前景［4］。就微生物脂肪酶而言，虽然在产酶菌株选育、培养条件、酶的性质及工业应用上已进行了多年研究，但由于脂肪酶的结构及性质的多样性、酶的不稳定性、底物的水不溶性、酶的来源不足、提纯困难和应用范围不广泛等问题，脂肪酶的研究进展及工业应用与蛋白酶、淀粉酶相比要慢得多，窄得多［5］。国内，脂肪酶的研究与开发曾被连续列为3个“五年”攻关项目，但目前对脂肪酶制剂的需求仍主要依

5、赖进口［6］。因此，该研究拟通过初筛和复筛从富含油脂的土壤中寻找高产脂肪酶的真菌，以期为扩大脂肪酶的菌源提供材料。1材料与方法1.1样品1.1.1供试土样8个土样分别采自保定市周边植物油厂、餐厅、菜市场、屠宰场等周围富含油脂的土壤。1.1.2试剂聚乙烯醇（PVA，聚合度1750±50）购自天津市化学试剂三厂；橄榄油购自上海医药（集团）上海化学试剂公司；其他生化试剂或化学试剂均为进口或国产分析纯。1.1.3培养基富集培养基：每升含0.5g(NH4)2SO4，0.1gNH4NO3，0.1gNaCl，0.1gMgSO4·7H2O，0.5gK

6、2HPO4，0.1gFeSO4·7H2O，10mL橄榄油，用0.1mol/LNaOH调pH8.0。初筛培养基：每升含0.5g(NH4)2SO4，0.1gNH4NO3，0.1gNaCl，0.1gMgSO4·7H2O，0.5gK2HPO4，0.1gFeSO4·7H2O，20g琼脂，121℃灭菌20min后，于60℃左右加含0.2%溴甲酚紫的聚乙烯醇橄榄油乳化液12mL。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。PDA培养基：马铃薯200.0g/L，蔗糖20.0g/L，琼脂20.0g/L。PDB培养基不添加琼脂。发酵培养基：每升含1.0g(N

7、H4)2SO4，1.0gMgSO4·7H2O，1.0gNaH2PO4，2.0gK2HPO4，10mL橄榄油，20g黄豆粉，10g蔗糖。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。种子培养基：每升含5.0g(NH4)2SO4，1.0gK2HPO4，0.5gMgSO4·7H2O，20g葡萄糖，25g蛋白胨，10mL橄榄油。用0.1mol/LNaOH调pH8.0。1.2试验方法1.2.1产脂肪酶菌株的筛选1.2.1.1富集培养将采集的土样10g溶于90mL蒸馏水中，充分摇匀，取上清液2mL加入到含20mL富集培养基的l00mL三角瓶中，30℃、

8、200r/min振荡培养2d。再次取1mL富集培养液转接到新的20mL富集培养基中，进行第2次富集。共富集3次。1.2.1.2平板分离将第3次富集培养液采用梯度稀释法稀释后涂布于筛选培养基上，30℃恒温培养72h，紫外灯