油菜基因转化

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1、山西大学学报(自然科学版)28(2):192~195.2005JournalofShanxiUniversityO、Jat.Sci.Ed.)文章编号:0253-2395(2005)02-0192-04农忏菌介导抗虫基因转化芥菜型油菜的研究周小梅李君剑1，赵军良2，梁爱华2龄0.山西大学生命科学与技术学院，山西太原030006;2.山西大学化学生物学与分子工程教育部重点实验室，山西太原030006)摘要:用农杆菌介导法对芥菜型油菜进行了转化，并对影响根癌农杆菌转化效率的因素进行了研究，建立了以油菜子叶柄为外植体的转化体系.用携带喝

2、毒素(BmKITs)和几丁质酶(chi)双价基因的农杆菌转化油菜，共获得了抗卡那霉素的再生苗153株，移栽成活21株.对成活植株进行了PCR分子检测，证实有外源基因的整合.转基因植株形态正常，开花、结实.关键词:芥莱型油菜;根癌农杆菌:子叶柄;转化中固分类号:Q943文献标i只码:A随着基因工程技术的发展，利用植物基因工程的方法获得转基因抗虫植物日益增多.目前主要用的抗虫基因是Bt基因[IJ和植物来源的蛋白酶抑制剂基因，它们都有一定的杀虫效果，但随着转抗虫基因植物在大田中的应用，昆虫的抗性问题随之产生，解决问题的方法之一是联合使

3、用两种或两种以上的具有不同杀虫机制的抗虫基因，使昆虫产生抗性的几率大大地降低.由于目前转化油菜主要集中在甘蓝型油菜[Z~5]，芥莱型油菜的转化很少，因此我们将实验室克隆井构建的双价抗虫基因，用农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)法转化芥菜型油菜，建立起芥莱型油菜(Brassicajuncea)的转化体系，同时获得具有抗虫性的油菜转化体，为以后进一步的转基因研究提供依据.1材料和方法1.1植物材料供试的品种是芥菜型油菜33B和918B.选取饱满的油菜种子，用体积分数为70%乙醇浸泡3min，质量浓度(下同)为

4、0.1%HgCI2溶液表面灭菌5min，无菌水冲洗4~5次Kam5a11sam1HindmHindm后，播种于MS[6J固体培养基上，在25"C下，光强4000Ix~10000lx和每天光照16h条件下培养成苗，取5d苗龄的子叶柄作为农杆菌的转1'8(1)BmK355355chi355(R)化材料.1.2菌种和质粒图1pbn01携带基因BmKITs-chi融合基因所用农杆菌EHA105其中含植物表达载体质粒pBIl01，该质粒含有昆虫特异性的蝠毒素基因(BmKITs)和几丁质酶基因(chi)(如图1).1.3根癌农杆菌转化和植株

5、再生将农忏菌单菌落接种于含有Km50mg/L、Str125mg/L的液体YEP培养基中，振荡培养(28"C,收稿日期:2004-06-21;修回日期:2004-09-21;作者简介:周小梅0959-).女，湖南保靖人，副教授，研究方向:植物基因工程.通讯作者:梁爱华.aliang@sxu.edu.cn周小梅等:农杆菌介导抗虫基因转化芥菜型油菜的研究193200r/min)24h后，取0.25mL的菌液转接于25mL与上述同样的培养基中，在同样的条件下培养16h后，稀释10~15倍使其OD600约在O.5左右，用于转染子叶柄.取5

6、d苗龄的无菌苗剪取子叶柄接于预培养基CMS+2，4-D1mg/L十l!糖30g/L,pH5.8)上预培养2d;取子叶柄浸泡在农杆菌菌液中10min，取出子叶柄用无菌撞纸吸干，转入共培养基CMS十6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+AgNOa7.5mg/L十煎糖40g/L，pH5.的中暗培养2d;共培养结束后，将于叶柄转入含有350mg/L接韦青霉素的无菌水中洗涤10min，取出井用无菌滤纸吸干，再转入诱导培养基(MS十6-BA2mg/L+NAA0.5mg/L+AgNOJ7.5mg/L+Km10mg/L+搜节青霉素500mg

7、/L+蔚糖40g/L,pH5.8)上，约30d后将分化出的芽丛取出，切去愈伤组织，接人生根培养基(MS十NAA0.2mg/L十Km10mg/L十援韦青霉素500mg/L十l!糖30g/L，pH5.的1.4植物DNA提取和PCR检测用CTAB法提取油菜再生植株基因组DNA;做目的基因的PCR扩增检测.BmKITs的PCR反应参数为:94'C变性5min;然后按以下参数扩增30个循环:94'C变性30s,50'C退火30s;最后72'C延伸7min.chi的PCR反应参数为:94'C变性5min;然后按以下参数扩增30个循环:94'

8、C变性30s，55"C退火45s,72℃延伸45s;最后72'C延伸7min.扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶平板上电泳，澳乙键染色，凝肢成像系统下观察井照相.2结果与讨论2.1表面消毒剂的效果在种子消毒时我们使用了不同的表面消毒剂(单位为质量被度，下同)，即2%、