骨质疏松症防治药物的体外细胞药效评价

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1、58CHINESEJOURNALOFOSTEOPOROSISVol.5No.21999·药物研究·骨质疏松症防治药物的体外细胞药效评价王洪复　金慰芳　高建军　　骨质疏松症已成为人类老年时生活质量下其具有增殖分化的能力,是观察增殖能力和功降和寿命缩短的主要原因之一,因而对有效防能表达的理想材料。治骨质疏松症的药物研究是近四分之一世纪以2)细胞收集　取材于头盖骨培养成骨细胞来十分重视的课题。随着细胞实验技术和分子应用酶消化法,酶消化能去除细胞间质,使细胞生物学技术的发展,骨质疏松症防治药物的研松散分离。标本先经0125%胰蛋白酶预消化15究在细胞与分子水平阐明了骨质疏松症病

2、理机～20分钟,以清除掉纤维组织细胞。然后以制的基础上,又取得了长足的进展。骨质疏松症011%Ê型胶原酶,在37℃环境中振荡(50次左的发生与成骨细胞和破骨细胞的功能失偶联有右ö分)消化60分钟,以1000rpm离心收集细关,因而在细胞水平上观察药物对骨细胞功能胞。可再重复胶原酶消化60分钟,以收集尽可的调整作用是评价骨质疏松症防治药物药效的能多的细胞。胰蛋白酶预消化分离的细胞,90%方法之一。本文分别就成骨细胞药效和破骨细为成纤维细胞,以后由胶原酶消化分离的细胞,胞药效评价方法作一抛砖引玉的介绍,以供骨95%为成骨细胞和骨细胞。质疏松症防治药物研究的参考。3)细胞培养

3、　将分离收集的细胞以5×3210öcm的密度接种于培养瓶中,置5%CO2、1　骨形成促进药物的体外细胞药效评价37℃培养箱培养。24小时可见细胞贴壁生长,成骨细胞是骨形成细胞,可合成、分泌20胞浆开始伸展,换新鲜培养液,以后隔48小时余种胶原与非胶原蛋白质和一些骨代谢局部调替换培养液。于接种后第4天作第二继代培养,节因子,在骨重建中生成类骨质和促进类骨质先以0125%胰蛋白酶使贴壁细胞消化松解、变矿化,形成的新骨质修补破骨细胞骨吸收形成圆,3～5分钟吸出消化液,加入新鲜培养液,轻的陷窝。成骨细胞功能减退致新骨形成量减少,摇,细胞即脱壁。以5×103öcm2的密度移入含对

4、骨吸收陷窝的修补能力减弱,造成骨小梁变培养液的新培养瓶继续培养。培养液是维持细细、薄弱、穿孔,皮质骨出现多孔性改变。因此,胞生存和生长所需的基本营养溶液,常用成骨细胞骨形成促进药物是防治骨质疏松症的MEM(minimumEaglemedium)、10%小牛血主要途径之一。为此,必需建立成骨细胞体外培清或胎牛血清、青霉素、链霉素组成,用时新鲜养技术和骨形成功能检测指标。配制,冷冻保存。111　成骨细胞体外培养技术112　成骨细胞鉴定　为确认所培养的细胞为1)取材　以新生(24小时或1～3天)大、成骨细胞,须以一定的特异性指标对培养细胞小鼠或19～21天妊娠胎鼠的头盖骨为材

5、料,分进行鉴定。主要指标为:离培养的细胞系为有分化潜能的前成骨细胞,1)形态观察　在倒置相差显微镜下观察,成骨细胞呈三角形、多角形和纺锤形,胞浆丰富作者单位:200032　上海医科大学放射医学研究所,老年的向外伸展,伸出几个突起与邻近的细胞伸出医学研究中心骨代谢研究室的突起相联。胞核大而清晰,呈圆形或卵圆形,©1995-2005TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.　中国骨质疏松杂志　1999年5月第5卷第2期59含1～2个核仁(照片1)。照片3PAS染色,OB胞浆显红色照片1　活体观察,OB呈不规则多

6、角形,阳性颗粒　×100单个卵圆形核　　　×1002)ALP染色反应　成骨细胞含丰富的碱性磷酸酶(ALP),是成骨细胞的特异标志酶。于培养6天,应用改良的Gomori氏钙钴法作细胞化学染色,成骨细胞胞浆可见棕褐色阳性颗粒(照片2)。照片4ARS染色,矿化结节显红色反应　×401)增殖率测定　MTT[32(4,5dimethyl2thiazol222yl)22,52diphenyl2tetrazoliumbro2mide]法测定成骨细胞存活和增殖具有简便、迅速、准确、安全等优点。MTT是一种淡黄色唑照片2ALP染色,OB胞浆显黑色氮盐,是线粒体脱氢酶的作用底物,经活细胞作

7、阳性颗粒　×100用后还原为不溶于水的蓝紫色甲　(formazan)3)PAS染色反应　成骨细胞胞浆含丰富结晶,溶解后在560～610nm有一个较宽的最的基质前体成分,应用过碘酸2Shiff氏法细胞大吸收峰,用分光光度仪可测定其含量。A值化学染色,呈红色阳性反应(照片3)。大小与活细胞数之间有良好的线形关系。本实4)矿化结节形成　培养10～14天的成骨验室测定条件为:(1)测定时换成无血清培养细胞具有形成矿化结节的能力,是成骨细胞的液;(2)测定波长570nm;(3)37℃、5%CO2,重要标志。加入B磷酸甘油可诱导成骨细胞分MTT孵育4