HCVRNA复制过程中5_UTR与3_UTR作用的初步探讨

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1、第’卷第+,期100’年.月科学技术与工程#BAK’%BK+,STAQ100’+,期+M.+9+E+’#100’&+,90D*’9吕0,欣!等"!"#J4$N6%?&46复)制64O过?B程AB中PQ’C!(?R)$G与?P*N?!6(6)>N$?作P用的初步探讨4100’J4NK)64OKG?P?PK医药卫生!"#$%&复制过程中’!()$与*!()$作用的初步探讨吕欣徐志凯薛小平-尹文雷迎峰杨敬孙梦宁韦三华胡兴斌#第四军医大学微生物学教研室!西安.+/0*1$摘要构建具有不同类型和长度的’!非编码区2()$3及*

2、!()$的丙型肝炎病毒%!"#&全长45%&克隆!体外转录制备$%&!转染肝癌细胞!6781!研究不同$%&转录体在细胞内的复制情况’通过$)9:"$与;6<=6>?@AB=等方法证明"蛋白编码区来源于+C基因型并具有+@型’!()$及*!()$2全长或缺失DE?=保守区F的1种嵌合型!"#$%&!都可以在病毒易感细胞中复制和表达(而以脑心肌炎病毒2GH"#F内核糖体进入位点2I$GJF替代!"#’!()$的嵌合型$%&转染细胞!检测不到病毒正)负链$%&与蛋白表达’以上结果说明!"#+@型’!()$与*!()$可以

3、支持+C型病毒$%&的正常复制!*!()$保守区的存在与否!对病毒复制影响不大’关键词丙型肝炎病毒嵌合体’!非编码区*!非编码区感染性$%&中图分类号$*.*K1+(文献标识码&丙型肝炎病毒#!"#&基因组为正链$%&!全$N46教授惠赠’宿主菌大肠杆菌SH+0D为本室保存!长约DKMU@!含有单一开放读框VW$XF!编码约人肝癌细胞系!6781细胞株由本校病理学教研室惠*000多个氨基酸组成的多聚蛋白前体’W$X两赠’侧具有非编码区#()$&!’!()$约*,+?=!高度保+,-主要试剂守!含有内部核糖体进入位点#

4、I$GJ&!在!"#蛋所用试剂购自%GZ))CUC>C)8N@4BZ$[):>B6PC白翻译过程中起重要作用(*!()$由高变区)及华美生物工程公司’!"#%J*单克隆抗体由本室7BAQ(Y("区及一段DE?=的保守区组成!认为与复制备’制起始有关’本研究通过构建具有不同长度和类+,*引物型的’!及*!()$的!"#全长45%&克隆!体外转录所有引物均由赛百盛生物工程公司合成!其中作逆制备$%&转染肝癌细胞!检测不同$%&转录体在转录时用于检测正)负链的引物位于!"#?<’@!上游引物细胞内的复制情况!对病毒复制过

5、程中’!()$与为#M’1*M.,?=&"’!9)&)8&)&"""8")8))))8&")"9*!()$作用做一初步研究’*!!下游引物与#+0+E*+0,0&?=反向互补"’!98"88&8)&"")88)"&)&8"")"9*!’+材料与方法+,.各种重组体的构建+,+质粒!菌株和细胞株在质粒*0++与ZZ.的基础上利用质粒自身有限含有!"#+C型2!..株F结构基因与非结构基因的单酶切位点!以:"$扩增)酶切)连接等方法构建的质粒*0++!及含有!"#+@型#"B?+株&’!()$)非结具有不同组合’!()$

6、与*!()$的嵌合型全长45%&克构基因与*!()$的质粒ZZ.由美国洛克菲勒大学隆!!"#嵌合体基因组组成及命名见图+!其中!X[T=>A基因由!"#+C蛋白编码区和+@型’!()$和*!()$基因组成!!X[T=><与!X[T=>A相比缺失*!()$100’年*月1,日收到国家自然科学基金#*0*.+1E0&最后DE?=保守区(在此基础上!以GH"#I$GJ取代和第四军医大学博士课题#100*00’&资助!"#+@型’!()$基因!分别命名为*0++T=><与第一作者简介"吕欣#+D..*&!女!博士研究生’*0

7、++T=>A’L通讯作者简介"薛小平!教授’-(*科学技术与工程!卷!"#体外转录制备感染性$%&6结果转录反应体积为!/!0$含下列成份"1234单切线性化的重组体%$5约(6!!7$8$29:;)/<$&/"转6"!)*+嵌合体$%&在转染细胞中的复制录缓冲液!!0$’6!==>?@0)"$A1&/!0$!/==>?@0收集转染细胞培养上清液和细胞$进行8AU1M8%AA!!0$A+8$5聚合酶!/<$补加无8$5酶的三分析$转染在’)孔板进行$(/&&

8、B%然后用无8$5的%$5酶的细胞约’/I死亡$但细胞状态很快恢复$经传代扩消化$AC:D>?法提取转录产物&大培养$取部分细胞AC:D>?提取8$5$除在转染后第&!"’$%&转染细胞代从细胞中8AU1M8检测出正链外$其后一直未再检转录参照0:E>FG3H2=:;G’///说明书进行$转染测到JMR正)负链&而经JV0