青枯菌II型分泌系统编码基因克隆

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1、农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2008,16(1):138~141·研究论文·青枯菌域型分泌系统编码基因的克隆*张杨, 张争, 徐进, 许景升, 何礼远, 冯洁** (中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京,100094)摘要：植物青枯菌域型分泌系统与致病蛋白的分泌密切相关。编码青枯菌()域型分泌系统的基因簇由12个基因组成，通过设计适合高GC%含量基因扩增的PCR反应体系，成功克隆了编码青枯菌域型分泌系统的全部12个基因。分别将基因连接到酵母双杂交系统的诱饵及捕获载体上，构建了基因

2、诱饵库和捕获库。经序列测定证明12个基因读框正确，保障了其在酵母系统中的表达。关键词：青枯菌;域型分泌系统;基因克隆;基因;酵母双杂交系统中图分类号:S188文献标识码:A 文章编号:10061304(2008)01013804CloningofGeneEncodingType域SecretorySystemof ZHANGYang,ZHANGZheng,XUJin,XUJingsheng,HELiyuan,FENGJie** Type域secretorysystemisassociatedwithsecretionofpathogenicproteinsof.T

3、hegeneclusterencodingtype域secretorysystemofconsistsof12genes.AllofgeneswereclonedsuccessfullybydesigningoptimalPCRreactionsystemsuitableforhighcontentofGC%.The12geneswereligatedintobaitandpreyvector,respectivelytoconstructthebaitandpreypoolofyeasttwohybridsystem.Theopenreadingframesof

4、12geneswereverifiedbysequencingtoensurethegenesbeexpressedrightlyinyeastsystem. ;type域secretorysystem;genecloning;genes;yeasttwohybridsystem细菌通过精巧的蛋白传输系统，产生各种致病和系统定殖维管束的能力。植物病原细菌通过T2S有关的毒性因子和效应子（effector）(Koster., 分泌降解植物细胞壁的酶及多种毒性因子，破坏寄2000)。细菌的分泌系统是转移所分泌蛋白和其它分主细胞，导致组织坏死，T2S在细菌的致病过程中同

5、子最重要的系统，主要有4种类型的分泌系统。人样具有举足轻重的作用（Genin .,2002,2004）。类、动物和植物病原细菌通过域型分泌系统（T2S）青枯菌是世界范围内最重要的植物病原细菌之向细胞外分泌各种蛋白，包括胞外酶、蛋白酶、毒素一，寄主范围多达50个科200多种植物，对许多重和毒性因子，这些胞外蛋白毒性因子通常破坏寄主要经济作物的生产造成严重危害，属于典型的土传细胞，引起组织坏死和病害（Sandkvist, .,1997; 细菌性病害。通过T2S分泌的多种胞外毒性蛋白是Chial .,2003）。域型分泌系统由12~15种分泌途导致寄主植物萎蔫的重要因素

6、。本研究组利用转径转膜蛋白（probablegeneralsecretorypathway 座子Tn5诱变技术，获得了国际上第一例青枯病菌transmembraneprotein,GSP）组成一个复杂的分泌胞外蛋白输出功能缺失突变株，突变株对马铃薯和装置，通过二步转移将蛋白质从细胞内运输到细胞番茄植株的致萎能力大大降低，缺失的基因片段涵外（Lory,1998）。盖了编码GSP蛋白的6个基因，证明基因尽管芋型分泌系统对细菌的致病性贡献最大，簇在青枯菌的致病过程中起着十分重要的作用但研究发现当基因缺失后，细菌仍然具有侵染(Kang ,1994;何礼远,1995;冯洁等

7、,2007)。*基金项目:国家重点基础研究发展规划(973)项目(No.2002CB111400),国家科技支撑计划项目(No.2006BAD08A14),国家高技术研究与发展计划(863)项目(No.2006AA10Z432)和国家自然科学基金项目(No.30671418)资助。**通讯作者。Authorforcorrespondence.博士，研究员，主要从事细菌致病分子机制及寄主植物抗病基因工程研究。Email:.收稿日期:20070531接受日期:2007719第1期张扬等:青枯菌域型分泌系统编码基因的克隆139本研究从

8、青枯菌GM