植物基因工程

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1、植物基因工程植物生物工程教研室第一章抗植物病虫害基因及其应用第一节抗植物虫害基因及其应用第二节抗植物病毒基因及其应用第三节抗植物真菌病害基因及其应用第四节抗植物细菌病害基因及其应用第一节概述一、作用及意义二、抗性基因的来源三、抗性基因分类一、作用及意义应用抗病虫害基因具有以下优势：1.育种周期短、效率高、成本低。2.提高产量和品质。3.降低生产成本。4.防止化学农药污染，避免破坏生态平衡。5.克服亲本基因资源缺乏。6.抗性性状具有连续性和整体性。二、抗性基因的来源根据基因来源分为三类：1.植物组织如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因。2.动物如杀菌肽（cecro

2、pins）基因。3.微生物如Bt杀虫结晶蛋白基因。三、抗性基因分类据基因的作用功能和对象分为：1.抗虫基因。2.抗病毒基因。3.抗真菌和细菌基因。第二节抗植物虫害基因及其应用一、Bt基因及其应用二、蛋白酶抑制剂基因及其应用三、植物凝集素基因及其应用四、淀粉酶抑制剂基因及其应用一、Bt基因及其应用Bt基因的作用原理2.ICP的分类、结构及抗虫谱Bt基因的应用4.存在的问题及对策1.Bt基因的作用原理Bt基因：是从微生物苏云金杆菌（Bacillusthu-ringicnsis）分离出的苏云金杆菌杀虫结晶蛋白基因，简称Bt基因。苏云金杆菌属于革兰氏阴性，形成

3、孢子细菌。在芽胞形成过程中，可产生伴胞晶体，它由一种或多种蛋白组成，具有高度特异性杀虫活性，这种蛋白通常被称作δ-内毒素（δ-endotoxins）或杀虫结晶蛋白（in-secticidalcrysta1protein，ICP）。作用原理：ICP通常以原毒素（protoxin）形式存在，当昆虫取食ICP后，原毒素在昆虫的消化道内被活化，转型为毒性多肽分子。活化的ICP与昆虫肠道上皮细胞上的特异性结合蛋白结合，全部或部分嵌合于细胞膜中，使细胞膜产生一些孔道，细胞因渗透平衡糟破坏而破裂。导致昆虫幼虫停止进食，最终死亡。ICP的活化过程：首先ICP溶解在昆虫

4、的肠道里（ICP在碱性条件可溶，而在中性条件下不溶），然后，在蛋白酶的作用下，通过专一性蛋白酶水解切割，ICP被活化。活化的ICP不被胰蛋白酶或其它蛋白酶破坏。2．ICP的分类、结构及抗虫谱据抗虫谱和序列同源性分为四种类型：类型I（CryI）抗鳞翅目（Lepidoptera）昆虫，对其幼虫有特异的毒性作用。类型II（CryII）抗鳞翅目和双翅目（Diptera）。类型III（CryIII）抗鞘翅目（Coleoptera）昆虫。类型IVw（CryIV）抗双翅目（Diptera）昆虫。类型V（CryV）抗鳞翅目和鞘翅目。近年Payne等人则发现了具有抗膜翅

5、目（Hymeno-ptera）以及抗线虫（Nematodes）的ICP。在每种主要类型中，据序列同源性，ICP又划分为若干亚类例如，CryI又分为IA(a)、IA(b)、IA(c)、IB、IC等。ICP的结构CryＩ蛋白为长1100～1200个氨基酸的多肽，大小为130～140kD，其毒性多肽分子是约60～70kD的核心片段。活性区在氨基端，而原毒素羧基端至少一半以上的氨基酸序列没有毒性功能。只保留编码毒性核心片段的核苷酸序列就能达到抗虫目的。如，Bt2编码的最短毒性片段位于29至607氨基酸残基处，进一步从基因3´端删除4个密码子（codon）或从5

6、´端删除8个密码子，将完全丧失产物的毒性功能。3.Bt基因的应用1987年比利时的Vacek等人利用农杆菌介导法首次获得了转基因烟草植株。他们使用全长的CryIA（b）基因编码1155个氨基酸和该基因保留了5ˊ端编码毒蛋白核心区域的缺失片段（编码610个氨基酸）。转基因植株对烟草天蛾（ManducaSexta）幼虫的抗性为75％～100％。美国Monsanto公司的Fischhoff等人（1987年）获得转Bt基因的番茄植株。他们用带有CaMV35S启动子的CryIA(b)基因转化番茄品系VF36。获得了对烟草天蛾显示出高抗虫活性的转基因植株。但因IC

7、P表达水平低，对番茄果螟（Heliothisvirescens）的抗性不强。目前全世界已有许多不同类型的ICP基因转入多种作物，如烟草、番茄、玉米、棉花、水稻、苹果、核桃等。研究结果表明：一般用全长CryIA基因转化植物，ICP在转基因植物中表达量很低，甚至检测不到，其抗虫效果差或不具抗虫性。在高抗虫性的转基因植株中，每毫克可溶性蛋白中约有2.6～190ng的ICP。4.存在的问题及对策（1）ICP在植物中表达水平低（2）昆虫对ICP产生抗性（3）抗菌谱窄（1）ICP在植物中表达水平低原因：主要是mRNA不稳定和翻译效率低。天然的Bt基因富含A、T碱基

8、,而植物基因富含G、C碱基,可能导致Bt基因转录的末成熟终止（prematuretranscr