荧光定量PCR的原理及临床应用2学生讲课HCMV

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1、荧光定量PCR的原理及临床应用苏晓霁如何做一个“聪明”的实习生实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。如何做到：①实习之前要复习理论知识和实验课内容“理论先行”②实习过程中要“聪明”③做好实习笔记，用心思考，实习之外下功夫如何做一个“聪明”的实习生聪明耳：认真听老师的说明和讲解看：仔细看老师的操作问：有疑问要多提问，多讨论心：要用心去思考日月：要每天每月坚持做到内容概要PCR的定义和原理荧光定量PCR的原理和分类荧光定量PCR结果的分析荧光定量PCR在临床的应用PCR的定义PCR是Po

2、lymeraseChainReaction的缩写，中文称为聚合酶链式反应，由变性、退火及延伸几步反应组成一个周期,循环进行,可使目的DNA得以迅速扩增。由美国PE公司遗传部的Dr.Mullis发明，由于PCR技术的跨时代意义，Mullis获得了1993年诺贝尔化学奖。PCR的原理变性：双链DNA在高温下解开成单链的过程。温度一般为95℃左右。5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’

3、3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’加热PCR的原理退火：温度下降后，两条配对的单链DNA重新结合为双链的过程。温度一般为50~60℃。5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT降温PCR的原理延伸

4、：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应。温度一般为72℃左右。5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTCGGACTCGACACT5’…CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGA…3’3’…GGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT…5’CCACTGCCTCTC……CCTGAGCTGTGAGGTGACGGAGAG……GGACTCGACACT恒温普通PCR的原理普通PCR的原理PCR反应成分：1

5、.模板DNA2.引物3.四种脱氧核糖核苷酸4.DNA聚合酶(Taq酶)5.反应缓冲液、Mg2+等6.荧光探针（荧光定量PCR）Taq酶的发现在Taq酶发现之前，实验室的PCR反应中运用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ι的Klenow片段。Klenow酶不耐高温，90℃加热后会变性失活，每次循环结束都要加入新鲜的酶。而且DNA的延伸是在37℃完成，模板和引物容易错配，造成反应的特异性很差。Taq酶的发现美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发现了嗜热菌(Thermusaquaticus)株，Cetus公司研究人员从中分离了TaqDNA聚合酶

6、特点：①耐高温：70℃2h活性>90%，93℃2h活性>60%，95℃2h活性>40%；②延伸温度较高(一般为72℃)：大大提高了扩增特异性、灵敏性和扩增效率。荧光定量PCR概念：在PCR反应中加入荧光基团，利用荧光信号累积或变化实时监测整个反应过程，最后通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems，ABI公司推出，实现了PCR从定性到定量的飞跃。实时荧光定量PCR的原理利用荧光信号的变化实时监测PCR反应的每个循环的扩增产物量的变化。通过Ct值和标准曲线

7、分析对起始标本的模板量进行定量分析。与普通PCR的比较普通PCR完成后，一般只对扩增的最终产物量进行分析，分析结果多为定性或者半定量结果。荧光定量PCR通过监测荧光值的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化，分析结果为定量结果。与普通PCR的比较普通PCR完成后，才能进行扩增产物的分析，而且分析的过程可能产生一定的生物危害和环境污染。荧光定量PCR的扩增和产物分析过程是同时完成的，而且在封闭的反应体系中进行，比较安全，易于处理。常用的名词概念本底信号（Baseline）荧光阈值（Threshold）Ct值（Ctvalue）扩增曲线

8、前15个循环荧光信号的均值，可手动调节选择默认是第3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，也可手动调节扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数常用的名词概念ThresholdBaselineCtvalue荧光强度Rn扩增循环