酶江南大学生物化学课件食品学院

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1、第五节酶活力的测定一、酶活力、酶单位、比活力的概念酶活力（也称酶活性，enzymeactivity）∶是指酶催化一定化学反应的能力1、酶活力与反应速度(reactionvelocity/rate)酶活力的大小是用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的速度来表示的。酶催化的反应速度越快，酶的活力越高2、酶活力的单位(U,activityunit)1961年国际生化学会酶学委员会规定：在酶作用的最适条件下（最适底物、最适pH、最适缓冲液的离子强度及25℃）下，每分钟内催化1.0微摩尔底物转化为产物底酶量为一个国际酶

2、活力的单位。1IU=1μmol/min1972年国际生化协会酶学委员会推荐了一个新单位“katal”(简称kat)即∶1个katal酶活力单位是指在特定的条件下，在1秒钟内能转化1mol底物的酶量。Kat与U的换算关系如下∶1kat=6×107IU1IU=16.67nkat（n＝10－9)一般情况下，对于酶活力单位人们通常采用习惯用法。如∶α-淀粉酶的活力单位是指每小时催化1克可溶性淀粉液化所需的酶量来表示。也可以用每小时催化1ml2%可溶性淀粉液化所需的酶量为1个酶单位。再如∶蛋白酶的活力单位是每分钟分解酪蛋

3、白产生1μg酪氨酸所需的酶量。3、比活力(specificactivity)比活力的大小也就是酶含量（纯度）的大小，即每mg蛋白质所具有的酶活力，一般用U/mg蛋白来表示。对于酶制剂来讲，有时也用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位来表示(即U/g或U/ml)。对同一种酶来说，比活力越高，表明酶越纯。4、催化中心活性(转换数turnovernumber)∶是指酶在底物饱和时，每秒钟催化中心所转换底物的分子数。κcat：每秒钟每个酶分子转化底物的微摩尔数，在数值上κcat＝k3几种酶的最大转换数κcat二、

4、酶活力测定法常规测定酶活力的操作程序为：[1]、样品酶液适当稀释。[2]、在最适条件下进行酶促反应，并通过化学分析或仪器分析的方法测定反应物的消耗量或产物的生成量。[3]、根据酶单位定义和实验数据计算出酶活力。1、关于酶液的稀释2、关于酶促反应条件及保证措施3、关于反应量的测定第六节酶的分离、纯化目的：[1]、为了研究酶的理化特性(包括结构与功能，生物学作用等）。[2]、作为生化试剂及用作药物的酶，常常也要有较高的纯度。胞内酶的分离提纯步骤：1、选材2、破碎细胞3、抽取4、分离及提纯在酶的纯化过程中应该注意∶[

5、1]、防止酶蛋白变性。低温、快速、不能过度搅拌。全部操作需在低温下进行，一般在0～5℃，用有机溶剂沉淀时，在零下15～20℃下进行。[2]、随时测定酶活力和蛋白质含量，以便计算总活力和比活力。[3]、酶制剂的纯度应与使用目的相适应。5、纯化除去杂蛋白及非蛋白杂质，并提高酶浓度。常利用溶解性、电性、分子大小及某些条件下稳定性差异来纯化㈠.盐析、分级盐析㈡.有机溶剂沉淀㈢.选择性变性沉淀㈣.色谱法（层析法）吸附色谱包括离子交换色谱凝胶过滤色谱6、纯度鉴定方法主要有：电泳法比活测定7、保存最后需将酶制剂浓缩、结晶，以

6、便于保存。酶制品一般应在-20℃下低温保存。注意条件：干燥、低温、避光、避氧核酶(ribozyme)1、概念1982年Cech等研究rRNA的基因转录问题时发现：转录产物rRNA的前体很不稳定，在鸟苷（或5‘-GMP）和Mg2+存在下切除自身的内含子，使两个外显子拼接起来，变成成熟的RNA分子。这个催化反应是在完全没有任何蛋白质的存在下发生的，称之为自我剪切，证明了RNA具有催化功能。为了区别于传统的蛋白质催化剂，Cech给这种具有催化活性的RNA定名为ribozyme（ribonucleicacidenzym

7、e）抗体酶(abzyme)20世纪80年代后期才出现的一种具有催化活力的蛋白质，其本质上是免疫球蛋白，但在易变区赋予了酶的属性，所以又称为‘催化性抗体’（catalyticantibody）。是将抗体的多样性和酶分子的巨大催化能力结合起来的一种蛋白质分子设计的新方法。是利用抗体分子及其多样的结合专一性来产生新的酶。由于酶作用的实质是酶与底物专一性的结合形成过渡态，因此，用过渡态的类似物作为半抗原免疫动物，将有可能产生具有催化活性的抗体－－－抗体酶免疫球蛋白与抗体免疫球蛋白（Immunoglobulin,Ig）：

8、是指具有抗体活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。主要存在于血液和其它分泌液中。抗体（antibody.Ab)：是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的B细胞，即浆细胞所合成与分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。Ab是重要的免疫分子，主要存在于血液、体液和粘膜分泌液中，介导体液免疫效应。Ab=Ig,Ig≠Ab；Ab是功能描述，Ig是化学结构描述；第七节固定化酶(imm