植物组织培养实验

植物组织培养实验

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1、植物组织培养实验课件制作:沙莎实验一培养基贮备液(母液)的配制目的与要求:熟悉MS培养基的组成,掌握贮备液的配制方法.实验步骤:称量分别溶解混合定容。一,MS培养基的组成1、大量成分→贮备液Img/LNH4NO31650KNO31900CaCl22H2O440MgSO47H2O370KH2PO4170配制20倍浓度贮备液500mL.2、微量成分→贮备液IImg/LKI0.83H3BO36.2MnSO44H2O22.3ZnSO47H2O8.6Na2MoO42H2O0.25CuSO45H2O0.025CoCl26H2O0.025配制100倍浓度贮备液100mL.3

2、、铁→贮备液IIImg/LFeSO47H2O27.8Na2EDTA2H2O37.34、有机成分→贮备液IVmg/L肌醇100烟酸0.5盐酸硫胺素(VB1)0.1盐酸吡哆醇0.5甘氨酸2配制100倍浓度贮备液100mL.配制100倍浓度贮备液100mL.二,常用生长调节剂6-BA:1mg/mL(溶于少量1N盐酸后以蒸馏水定容)。NAA:1mg/mL(先用少量95%乙醇溶解后以蒸馏水定容)。三、作业:(一)一般可将MS培养基分为哪四个部分?分别含有几种试剂?各种试剂的浓度(mg/L)如何?(二)如需配制MS培养基的20×的贮备液I量为500mL、100×的贮备液I

3、I、III和IV各100mL以及BA和NAA(浓度为1mg/mL)各50mL,则应分别称取多少量的各种试剂?注意要点有哪些?贮备液I(g)贮备液III(mg)MgSO47H2O3.70500mLFeSO47H2O278100mLNH4NO316.50Na2EDTA2H2O373CaCl22H2O4.40生长调节剂KNO319.006-BA50mg50mLKH2PO41.70NAA50mg50mL贮备液II(mg)贮备液IV(mg)KI8.3100mL肌醇1000100mLH3BO362烟酸5MnSO44H2O223盐酸硫胺素1ZnSO47H2O86盐酸吡哆醇5

4、Na2MoO42H2O2.5甘氨酸20CuSO45H2O0.25称量溶解混合定容CoCl26H2O0.25实验二固体培养基的配制与灭菌一、实验目的:学习、掌握植物组织固体培养基的配制和灭菌方法。二、实验步骤:称量混合调pH值灭菌称量:按每瓶培养基终体积50mL计,称取适量的琼脂(常用量8g/L)和蔗糖(常用量30g/L),置于大烧杯中,加蒸馏水至需配培养基终体积的3/4左右,(加热)使之溶解。混合:分别加入一定量的贮备液I、II、III、IV和生长调节物质及其它特殊补加物,再加蒸馏水直至需配培养基的终体积。调pH值:充分混合后,在60℃水浴条件下用0.1mol

5、/L的NaOH和0.1mol/L的HCl调节培养基的pH值至5.8。灭菌:封严培养容器口后,120℃灭菌20min后,将培养基取出,置于水平台子上,在室温下冷却,备用。实验三外植体材料的预处理、 消毒及接种一、实验目的:熟悉外植体材料的预处理,掌握其消毒和接种方法。二、方法步骤:(一)对采来的植物材料进行适当的预处理。除去不需要的部分,将所需部分切割至适当大小,置自来水龙头下流水冲洗几分钟至几小时,主要视植物材料清洁程度而定。这在污染严重时特别有用。(二)用洗衣粉水(1~2角匙洗衣粉/100ml水)等浸洗上述植物材料约5min,再用自来水冲净洗衣粉水。这是进一

6、步减少污染的处理。同时配制消毒液:50%次氯酸钠溶液。(三)将接种用具、无菌水等从80℃烘箱中或直接从高压灭菌器中取出,置于超净工作台上。打开超净工作台中的紫外灯,在进行紫外线灭菌处理至少30min后关掉紫外灯。(四)操作人员洗手擦干,换上洁净工作服,戴上帽子以免头发散落以及带来污染。坐到超净台前,并将装有经湿热灭菌培养基的培养瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上,用70%酒精棉球擦手与器具外壁,即可对经上述预处理的植物材料进行表面灭菌处理,自此以后各步均须在超净工作台上操作。(五)具体首先将经上述预处理、沥干水的植物材料放入广口瓶或烧杯,向其

7、中倒入新鲜配制、浓度一定并且加有一定量(通常为灭菌剂消毒液的0.5%,或每100mL消毒液滴加10~15滴)Tween-80(土温-80)等表面活性剂的消毒液适量(液面高度超出植物材料至少0.5cm),开始计算灭菌时间。也可在使用上述灭菌剂之前,先将植物材料浸于70%乙醇灭菌10~30秒。(六)在持续灭菌时间内定时用玻璃棒轻轻搅动,以促进植物材料各部分与消毒液充分接触,驱除气泡,使灭菌彻底。在灭菌时间结束前1min时,即可开始用玻璃棒等轻轻压住植物材料将消毒液慢慢倒入废物缸,注意勿使植物材料滑出。接着立即倒入适量无菌水,轻搅植物材料以清洗去除灭菌剂残留。一般表

8、面灭菌时间的计算是从倒入消毒液开始,到

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