脂肪细胞分化方法 3T3-L1 Differentiation Protocol

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1、3T3-L1DifferentiationProtocolStep1:3T3-L1细胞传代于35或60-mm培养板中，使用DMEM-F12培养基培养2day（以此为基点，即：诱导分化的第0day）。Step2:使用诱导液I诱导3T3-L1分化。加入配制好的诱导液I于3T3-L1细胞中，培养2day（诱导分化的第2day）。诱导液I：0.5mMIBMX;0.25μM地塞米松；1μg/mlinsulin;含10%FBS的DMEM-F12。Step3:使用无血清培养基清洗细胞，去除残余的IBMX和地塞米松。使用诱导液II

2、诱导细胞分化，并培养2day（诱导分化的第4day）。诱导液II：1μg/mlinsulin;含10%FBS的DMEM-F12。Step4:最后用普通DMEM-F12培养基培养并每2day换一次液。Step5:每次实验前，用serum-freeDMEM-F12或KRPbuffer培养单层细胞2h。Step6:用于实验的脂肪细胞应该在诱导分化后的8-12day之间为宜。这样的条件下≥95%的细胞表现为脂肪细胞的表型。Step7:OilRedOstaining鉴定分化后的脂肪细胞内的脂质，可以使用油红染色。细胞用PBS

3、轻轻冲洗2次，使用10%的formalin或4%paraformaldehyde室温固定30min。固定后的细胞使用新配制的OilRedOsolution染色（注意避光）1h，之后只用蒸馏水轻轻冲洗3次，最后观察结果。OilRedOsolution配制：0.5%（W/V）的OilRedO-异丙醇溶液。取0.5%的OilRedO-异丙醇溶液6份，加入4份的蒸馏水，配制成OilRedOsolution。Step8:获得结果并进行后期处理。Otherprotocolcanbeused:美国密歇根大学的3T3-L1细胞分化

4、的PROTOCOL(非常详细)3T3-L1DifferentiationProtocolMATERIALSDulbecco'sModifiedEaglesMedium(DMEM;GibcoBRL-Cat#11965-084:highglucose,withL-glutamine,withpyroxidineHCl,withoutsodiumpyruvate)CalfSerum(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot#1060198)FetalBovineSerum(GibcoBRL-Cat#10437

5、-028/Lot#1026566)-filtersterilize(0.22umfilter)beforemixedintoDMEMIsobutylmethylxanthine(IBMX;SigmaI-7018)Dexamethasone(SigmaD-4902)Insulin(Bovine;SigmaI-5500)MEMSodiumPyruvate(100mM;GibcoBRLCat#11360-070)Pen/Strep/Glutamine(100xP/S/G;GibcoBRLCat#10378-016)SOL

6、UTIONS10%CalfSerum/DMEM60mLCalfSerum6mL100mMMEMSodiumPyruvate6mL100xP/S/G500mLDMEM10%FBS/DMEM60mLFetalBovineSerum(FilterSterilized)6mL100mMMEMSodiumPyruvate6mL100xP/S/G500mLDMEMIBMXSolution(makefresh)a)DissolveIBMXinasolutionmadeof0.5NKOHtoafinalconcentrationo

7、f0.0115g/mL.b)Filtersterilizethrougha0.22mmsyringefilter.InsulinStockSolution167uM(1mg/mL)in0.02MHClFiltersterilizedthrough0.22mmfilterCanstoreat-20Cforlongterm,4Cshortterm.DexamethasoneStockSolutionsFreezerStock:10mMofDexin100%ethanol(storeat-20C)WorkingStock

8、:DiluteFreezerstockto1mMinPBSFiltersterilizeandstoreat4C.MDIInductionMedia(10mL/10cmplate;5mL/6cmplate)Torequiredvolumeof10%FBS/DMEMadd:1:100IBMX1:1000Insulin1:1000Dexamethasonewor