GBT27536-2011 猪流感病毒分离与鉴定方法.pdf

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1、ICS11．220B41圆雪中华人民共和国国家标准GB／T27536--2011猪流感病毒分离与鉴定方法Isolationandidentificationofswineinfluenzavirus2011-11-21发布2012—03—01实施宰瞀髅鬻瓣警矬瞥霎发布中国国家标准化管理委员会促19标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖置本标准按照GB／T1．1—2009给出的规则起草。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(sAc／Tc181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈

2、尔滨兽医研究所。本标准主要起草人：乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰。GB／T27536--201标准分享网www.bzfxw.com免费下载1范围猪流感病毒分离与鉴定方法本标准规定了猪流感病毒分离与鉴定方法。本标准适用于各种亚型猪流感的病原分离和鉴定。2试验材料、试剂2．1剪刀、镊子。2．21mL注射器。2．3单道及多道微量移液器、吸头。2．49～11日龄SPF鸡胚。2．5犬肾细胞(MDCK)。2．66孔培养板。2．7DMEM培养基。2．8HEPES缓冲液(1moI／L储存液)。2．9胎牛血清。2．10TPCK-胰蛋

3、白酶(胰蛋白酶经TPCK处理)。2．110．01mol／LpH7．o～7．4磷酸盐缓冲液(PBS)(参见附录A中A．1)。2．12磷酸盐缓冲液(pH5．9)(参见附录A中A．5)。2．130．85％生理盐水(参见附录A中A．2)。2．14阿氏(Alsevers)液(参见附录A中A．3)。2．150．5％红细胞悬液(参见附录A中A．4)。2．16胎球蛋白(参见附录A中A．6)。2．17过碘酸盐(参见附录A中A．7)。2．18亚砷酸盐(参见附录A中A．8)。2．19硫代巴比妥酸(参见附录A中A．9)。2．20无菌蒸馏水或去离

4、子水。3仪器GB／T27536--20113．1生物安全柜(柜内负压，有HEPA过滤器可避免细胞培养物污染及保护操作人员安全)。3．2孵化器。3．3COz培养箱。3．4台式高速冷冻离心机。3．537℃水浴加热器。3．6煮沸锅。3．7棉拭子(医用棉签)。3．8研磨器。标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27536--20114样品采集与处理4．1样品的采集病死猪，取肺脏或气管分泌物；待检活猪，用棉拭子(医用棉签)采集鼻腔深部分泌物。4．2样品的保存样品应置于特定的样品保存液中进行保存。一般采用磷酸盐缓冲液(

5、pH7．o～7．4，0．01tool／L)、0．85％生理盐水或者不含血清的细胞培养液作为保存液(含青霉素2000IU／mL、链霉素2000IU／mL、制霉菌素1000Iu／mL，牛血清白蛋白5mg／mL)。样品采集后应置于加冰的保温箱中、密封，24h内送至实验室进行处理或置--70℃保存。4．3样品的处理用剪刀采组织病料置于研磨器中，按质量体积比(1：1)加入样品保存液进行研磨；将棉拭子置于装有1mL样品保存液的离心管中，用镊子充分挤压后弃去拭子。以上样品室温静置作用30rain，4℃3000r／rain离心5rain

6、，取上清作为接种材料。5样品接种5．1鸡胚培养1mL注射器吸取处理好的样品，以0．2raL／胚的量经尿囊腔和羊膜腔途径接种9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3个胚，于35℃～37℃孵化箱内孵育72h～96h，弃去24h内死亡鸡胚。孵化至96h将鸡胚制冷后，无菌收取24h以后死亡鸡胚及96h仍存活鸡胚的尿囊液和羊水。5．2细胞培养在生物安全柜中操作，将60％～80％长满单层的MDCK细胞的6孔细胞培养板用细胞培养液(不含胎牛血清，含有TPCK处理的胰酶2btg／mL的DMEM培养基)洗三次，加入适量的处理样品，置于5％C

7、Oz、37℃培养箱中培养1h～2h，期间每隔30rain轻轻摇动一次。感作完毕，弃去感作物，用含有胰酶的培养液洗三次，加入适量的细胞维持液，5％CO：，37℃培养箱内继续培养5d～7d，期间观察细胞病变(CPE)的形成情况。如出现CPE(特征病变为：细胞肿胀圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部分或全部脱落)，收集细胞培养上清。5．3结果判定收获鸡胚液或细胞培养上清，测定其血凝活性(具体操作见6．1)。若HA反应阳性说明可能有粘病毒科的病毒，应采用HA-HI试验进行血凝素亚型的鉴定；若无血凝活性或血凝价很低，

8、应盲传3～5代，若仍阴性，则认为病毒分离阴性。6亚型鉴定6．1IIA试验6．1．1在微量反应板的1～12孔均加入0．05mLPBS，换吸头。6．1．2吸取0．05mL待鉴定病毒液，加入第1孔，反复抽打3～5次混匀。2标准分享网www.bzfxw.com免费下载GB／T27536--20116．1．3从第l孔吸取0．0