双水相萃取法

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1、双水相技术最早出现于1955年。近几年来,双水相技术在动力学研究、双水相亲和分离、多级逆流层析、反应分离耦合等方面都取得了显著的成绩。到目前为止,双水相技术几乎在所有的生物物质的分离纯化中得到应用:如氨基酸、多肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等,特别是成功地应用在蛋白质的大规模分离中。双水相萃取基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们在有机溶剂中的溶解度低并且会

2、变性，因此传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取技术(two-aqueousphaseextraction,ATPS)，又称水溶液两相分配技术(Partionoftwoaqueousphaseextraction)是近年来出现的引人注目、极有前途的新型分离技术。双水相萃取法的特点是能够保留产物的活性，整个操作可以连续化，在除去细胞或细胞碎片时

3、，还可以纯化蛋白质2～5倍，与传统的过滤法和离心法去除细胞碎片相比，无论在收率上还是成本上都要优越得多。双水相萃取法和传统的分离方法(如盐析或有机溶剂沉淀等)相比也有很大的优势，如以β-半乳糖苷酶为例，用沉淀或双水相萃取纯化的比较见下表。除此以外，处理量相同时，双水相萃取法比传统的分离方法,设备需用量要少3～10倍，因此已被广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病毒等产品的分离纯化和分析等。用此法来提纯的酶已达数十种，其分离过程也达到相当规模，如乙醇脱氢酶的分离已达到几十千克湿

4、细胞规模，β-半乳糖苷酶的提取也到了中试规模等。聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，由于相对分子质量较大，分子间的相互排斥作用与混合过程的熵增加相比占主导地位，一种聚合物分子的周围将聚集同种分子而排斥异种分子，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。这种含有聚合物分子的溶液发生分相的现象称为聚合物的不相容性。可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypr

5、opyleneglycol)/聚乙二醇和甲基纤维素(methylcellulose)/葡聚糖等。双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，例如，PEG/磷酸钾(KPi)、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于生物产物的双水相萃取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG，下相富含无机盐。1双水相系统均相区图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图a双节线系线b双节线均相区均相区两相区两相区系线临界点在系线

6、上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时，即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的分配系数均为1，因此K点称为临界点(criticalpoint)。上下相组成分别为T和B,2.双水相中的分配平衡与溶剂萃取相同，溶质在双水相中的分配系数也用m=c2/c1表示。为简便起见，用c1和c2分别表示平衡状态下下相和上相中溶质的总浓度。有关双水相系统中溶质分配平

7、衡的理论已有很多研究报导。但是，由于影响双水相系统中溶质分配平衡的因素非常复杂，很难建立完整的热力学理论体系。从双水相萃取过程设计的角度出发，确定影响分配系数的主要因素是非常重要的。已有的大量研究表明，生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:lnm=lnme+lnmh+lnmlme，mh，ml分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。1．静电作用非电解质型溶质的分配系数不受静电作用的影响，利用相平衡热

8、力学理论可推导下述分配系数表达式：lnm=-Mλ/RTm-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和成相系统有关的常数;R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度，K。因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变