《色谱知识介绍》PPT课件

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1、HPLC色谱知识及应用反相分配色谱极性:固定相<流动相固定相-非极性流动相(甲醇,乙腈）-极性非极性物质后出峰正相吸附色谱极性:固定相>流动相固定相-极性流动相(己烷,庚烷)-非极性极性物质后出峰正相色谱20%反相色谱80%正相&反相色谱硅胶基质-pH3~8Al2O3.nH2O-pH1~14聚合物基质-pH1~14高或低pH下,硅胶会溶解化学修饰困难孔结构复杂,孔径不均匀导致柱效不够高,有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损柱填料基质硅胶纯度•填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度色谱柱尺寸•填料床的长度

2、和内径颗粒形状•球型或不规则型粒径•平均颗粒直径,通常3-10µm表面积•颗粒外表面和内部孔表面的总和,以m2/gram表示孔径•颗粒的孔或腔的平均尺寸,范围80-300Å色谱柱物理性质C-18柱---性能影响因素键合类型•单体键合-键合相分子与基体单点相连•聚合体键合-键合相分子与基体多点相连碳覆盖率•键合相的键合量常用含碳量(C%)来表示，也可以用覆盖度来表示。所谓覆盖度是指参与反应的硅醇基数目占硅胶表面硅醇基总数的比例。封端•键合步骤之后,用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来色谱柱化学性质C-

3、18柱---性能影响因素A类硅胶OriginalZORBAXSIL(1970s)由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高(硅羟基的pKa低),导致碱性化合物发生拖尾B类硅胶(高纯)ZORBAXRx-Sil(1987)由于金属含量低,硅羟基pKa高,碱性化合物不发生拖尾C-18柱---性能影响因素色谱柱尺寸---对色谱分离的影响•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长•窄径柱(2.1mm)-检测器灵敏度高•宽径柱(3-21.2mm)-载

4、样量高C-18柱---性能影响因素颗粒形状---对色谱分离的影响当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时,球型颗粒可以降低柱压,延长色谱柱寿命C-18柱---性能影响因素球形不规则形粒径---对色谱分离的影响较小的颗粒柱效较高,但会引起柱压过高.3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品,而组份单一的样品多采用5µm的粒径1.8µm3.5µ5µm7µm10µm表面积---对色谱分离的影响高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力,柱容量和分离度.表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态

5、,对于梯度淋洗尤为重要C-18柱---性能影响因素孔径---对色谱分离的影响大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间,达到充分分离,改善峰形样品MW4,000,选择80Å的孔径样品MW>4,000,选择300Å的孔径键合类型---对色谱分离的影响单齿键合：提高传质速率,加快色谱柱平衡双齿键合：增加色谱柱稳定性,增加色谱柱的载样量C-18柱---性能影响因素CHCHCHCHCHCHOSiOOOOSiSiSiCHCHCHCHCHCHSi333333333333SiSiOOSiSiOO碳覆

6、盖率---对色谱分离的影响高碳覆盖率：提高分辨率,分析时间长低碳覆盖率：缩短运行时间封端---对色谱分离的影响封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现象对于极性样品,未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异C-18柱---性能影响因素固定相键合二甲基硅烷封端四甲基硅烷SiOOHOOCH3SiRCH3CH3SiCH3CH3SiRCH3R=C8,C18,etc.OOHOHOCH3SiRCH3CH3SiRCH3++ClCH3SiCH3CH3OHOHOHOHCH3ClR

7、CH3(TMS)传统键合及封端技术键合相种类化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。极性键合相：氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)——常用作正相色谱，极性强的组分保留值较大。极性键合相有时也可作反相色谱的固定相。非极性键合相：各种烷基(C1~C18)和苯基、苯甲基，极性弱的组分保留值较大。HPLC---色谱柱与pH的关系StableBondC18pH1~8Bonus-RPpH2~9ExtendC18pH2~11.5EclipseXDBC18pH2~9（可用于100

8、%全水相）未封端双封端三封端双封端HPLC---保留值与pH的关系pH变化值0.1RS变化值1.6色谱柱：ZorbaxStableBondC184.6X250mm,5um流动相：27%甲醇：73%磷酸pH2.5&2.6温度：500C流速：1.0mL/min.邻氯苯胺（pKa＝2.636)12346750123456Time(min)01234561234675Time(min)pH7.00pH7.25色谱柱:ZORBAXEclipseXDB-C84.6x75mm,3.5µm流动相: