阿霉素致心肌细胞氧自由基释放的分析

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1、摘要阿霉素(adriamycin，ADR)属于蒽环类抗生素，是一种高效的广谱抗肿瘤抗生素，临床上广泛用于治疗乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等多种恶性肿瘤。但阿霉素在临床化疗中的毒性反应呈现出明显的剂量一效应线性关系，即随着剂量的增加出现骨髓抑制、心脏毒性、脱发等毒副作用也愈加突出，尤其是严重的心脏毒性，可引起各种心律失常、充血性心力衰竭甚至死亡，因此大大限制了它的临床使用。阿霉素引发心脏毒性的作用机制有多种学说，其中氧自由基学说被多数研究者所认同。阿霉素的氧自由基学说认为，ADR进入心肌细胞后。在微粒体中由还原型辅酶II(NADPH

2、)及细胞色素P450还原酶提供一个电子转变为带一个多余电子的半醌ADR该半醌ADR又把此电子传递给氧分子(02)，使02变成超氧阴离子(．02’)；在线粒体中由还原型辅酶I(NADH)及NADH．氧化还原酶提供一个电子转变为半醌ADR并与02作用产生·02。，同时伴有过氧化氢(H202)生成增加。·02‘与H202通过Haber．weiss反应或Fenton反应产生羟自由基(·OH)。这些在心肌细胞中产生的氧自由基(OFR，包括·02。、OH、H202)作用于细胞膜及各种细胞器膜上的磷脂中的多价不饱和脂肪酸，形成脂质自由基

3、，引发脂质过氧化反应，使膜的结构发生改变、扭曲，并影响膜上功能蛋白质的位置及构型，最终导致膜的完整性遭到破坏，膜的流动性降低，通透性增加，容量调节功能及离子转运功能障碍，严重影响细胞的功能，造成心肌细胞损伤。氧自由基造成的心脏损伤作用近年来被作为基础医学和生命科学领域的研究热点。目前，在活体细胞中可标记氧自由基并对其进行实时监测定量的指示剂种类还比较缺乏，寻找一种特异性高、灵敏、可进行定量的氧自由基指示剂成为当前研究的一大重点。2008年，北京大学分子医学研究所程和平教授研究组研究发现了一种新的细胞超氧自由基生成事件，并命

4、名为“超氧炫”(superoxideflashes)，这是首次在活体细胞中观测到局部、间歇性、量子化超氧的产生。超氧炫为线粒体膜通透性转运孔道(mPTP)开放所触发，与线粒体电子传递链活性密切相关。上述发现是基于发明了中文摘要一种新颖的高特异性超氧指示剂，即基因编码的、定位于线粒体的可用于实时测量的荧光蛋白。本实验拟就阿霉素导致心肌细胞早期损伤的氧自由基学说进行研究，采用上述这种新型高特异性超氧指示剂“超氧炫”荧光蛋白，研究线粒体上氧自由基释放是否是阿霉素致心肌细胞损伤的早期事件，为阿霉素导致心肌细胞损伤的氧自由基学说提供

5、直接证据，同时，对药物所致细胞线粒体上超氧阴离子生成情况进行研究，为进一步利用此种高特异性超氧指示剂建立药物致心肌细胞损伤评价方法打下基础。1新生大鼠心肌细胞培养及腺病毒转染目的：建立新生大鼠心肌细胞培养方法，完成“超氧炫”腺病毒的扩增及转染，为下一步实验打下基础。方法：(1)新生大鼠心肌细胞的原代培养取新生72小时内的SD乳鼠，消毒，开胸，夹取心室部分，于冰浴的PBS液中洗涤，剪碎。消化6．8次后，过滤，离心，收集细胞，用培养液混悬，差速贴壁80分钟后，收集培养液中的非贴壁细胞，种于24孔板中，24小时后换培养基，然后每

6、隔1天更换培养基1次。(2)“超氧炫"腺病毒的扩增培养293A细胞，当细胞密度达到70．80％时，换液，加入腺病毒液，48．72小时后，当有70．80％细胞变圆漂起时，收集病毒，．80℃／37℃反复冻融3次，离心，收集上清液。如此重复扩增3轮。第四轮扩增时，当有50％细胞变圆漂起时，收集病毒，离心，弃去上清液，用lml培养基重悬细胞，．80℃／37℃反复冻融3次，离心，收集上清液，分装，．80℃储存。(3)“超氧炫"腺病毒的滴度测定在6孔板中培养293A细胞，当各孔细胞密度达到70．80％时，换液，加入稀释为10～、10～

7、、10一、104、106的腺病毒液，没加病毒的一孔细胞作对照。72h后选取刚好全部细胞变圆漂起或仅有少量细胞贴壁但细胞形态也已回缩的一孔，认为此孔病毒的MOI值约为10。(4)“超氧炫”腺病毒转染心肌细胞向新生大鼠心肌细胞和成年大鼠心肌细胞中分别加入适量的腺病毒，培养48．72h后，在激光共聚焦显微镜下观察转染结果。结果：(1)心肌细胞形态学观察24h后观察细胞已基本全部贴壁，贴壁后为梭形或菱形，有一部分细胞已开始搏动。继而细胞逐渐在皿底表面铺展，中文摘要并伸出伪足，形成不规则的星形并相互接触交织成网，在培养72h后可形成

8、呈放射状排列的细胞簇，其搏动已同步化。(2)“超氧炫”腺病毒的滴度测定72h后，对照孔的细胞已生长连接成片；lO。孔细胞全部变圆漂起，悬浮在培养基中；10之孔细胞绝大部分漂起，悬浮在培养基中，还有一小部分细胞贴壁，但细胞形态也已回缩；10。3孔和104孔细胞回缩变圆漂起、悬浮在培养基中的数量随着加入病毒