《蛋白质制备》PPT课件

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1、第二章蛋白质制备蛋白质分离纯化的一般程序蛋白质的粗分离蛋白质的层析分离蛋白质的电泳分离蛋白质的结晶内容提要（第二讲）（三）膜蛋白的释放膜蛋白外周蛋白固有蛋白去污剂阴离子去污剂（脱氧胆酸盐）阳离子去污剂（溴化十二烷基三甲胺）两性离子去污剂非离子型去污剂（二甲基十二烷基甘氨酸）（TritonX-100）增溶作用：抽提固有蛋白时，既要削弱它与膜脂的疏水性结合，又要使它仍保持疏水基暴露在外的天然状态。比较理想的增溶剂是去污剂。3.在低温（-20℃）下，用丙酮处理组织和细菌。（四）胞外酶的分离浓缩的方法是超滤。二、蛋白质的浓缩和脱盐1.除盐方法：⑴透析

2、法⑵纤维过滤透析法⑶分子筛层析法释放膜蛋白的方法：1.用磷酸脂酶A消化膜脂肪。2.在高pH和较高温度下进行超声作用。方法处理量操作时间操作难易透析纤维过滤透析分子筛层析少量或数十毫升大量样品少量或数十毫克5h以上0.5h数小时容易稍难稍难蛋白质的脱盐方法比较2.浓缩的方法⑴沉淀法⑵吸附到离子交换剂上⑶干胶吸附法⑷渗透浓缩法AB抽真空超滤液N2压力膜多孔支板磁力搅拌器超滤器⑸超滤浓缩法利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜(一种半透膜)除去，而蛋白质留在膜上，称为超过滤。超滤法是最近几年发展起来的一种新技术，利用分子大小不同，来分离蛋白

3、质。三、沉淀法分级蛋白质（一）盐析法蛋白质溶液盐溶现象盐析现象加盐盐浓度低盐浓度高在浓盐溶液中，蛋白质溶解度的对数和溶液中离子强度成正比㏒S=㏒S0-KsI盐析方程式：S-蛋白质在某一离子强度溶液中的溶解度I-中性盐的离子强度Ks-盐析常数S0-蛋白质在无盐溶液中的溶解度盐析法:加入中性盐，使各种蛋白质依次分别沉淀的方法．S0-某一蛋白质在特定条件下的溶解度Ks是盐析常数，与溶质的结构、盐的价数有关。如用β表示S0，盐析方程式可写为：㏒S=β-KsI盐析常数Ks代表盐析效率，它是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。Ks分段盐析法：当盐的种类确定后

4、，在一定pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变盐的I值，使不同蛋白质分离。对于同一种蛋白质，盐离子价数越高，盐析能力越强。PO43-﹥SO42-﹥C2O42-﹥（CHOHCOO-）2﹥AC-﹥Cl-﹥NO3-K+﹥Rb+﹥Na+﹥Cs+﹥Li+﹥NH4+Hofmeister序列：β-分段盐析法：在一定的I值下，提高改变pH及温度分离蛋白质。蛋白质浓度影响盐析界限蛋白质浓度高，盐析界限宽。蛋白质浓度低，盐析界限窄。蛋白质浓度在2.5～3.0%之间合适。求一定体积蛋白质溶液应加饱和硫酸铵的毫升数x：α-所需饱和度（%）V-蛋白质溶液

5、体积分段盐析：利用不同的蛋白质所带电荷、水化程度不同，所需盐浓度不同分离。x=αv100-α血浆清蛋白血浆球蛋白饱和（NH4）2SO4半饱和（NH4）2SO4盐析法优点：操作简便，使用广泛，中性盐对易变性的蛋白质有保护作用，能除去较多杂质，有纯化作用。盐析法缺点：分辨能力差，纯化倍数低。（二）有机溶剂沉淀法F-两个带电质点之间的作用力Q1Q2-两个带电质点电荷量r-两个带电质点之间的距离ε-是介电常数选择有机溶剂的原则：⑴必须能与水完全混溶；⑵不与蛋白质发生反应；⑶要有较好的沉淀效应；⑷溶剂蒸汽无毒，且不燃烧。F=εr2Q1Q2乙醇和丙酮使用

6、最广泛库伦定律（三）有机聚合物沉淀法（四）选择性变性沉淀法有三种方法：热变性pH变性有机溶剂变性有机溶剂沉淀法比盐析法分辨率高，广泛用于生产蛋白质制剂。PEG可沉淀蛋白质，聚丙烯酸可沉淀带正电蛋白质。分配层析原理（俄国植物学家LiBer1903年提出）混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相分配系数。层析系统固相液相半液相液相气相第三节蛋白质的层析分离固定相流动相（静相）（动相）支持物静相动相被分离的物质一、层析法的一般原理ABCDE321616168812412482212812345阶段层析柱分离物质示意图分配定律：质量分配系

7、数：D=k·VsVmVs-固定相体积Vm-流动相体积D﹤1，大多样品留在固相，样品流速慢；D﹥1，大多样品留在流相，样品流速快；D=0，样品留在柱顶；D无限大，样品流到柱底；溶质通过柱的速度决定于它的质量分配系数k=c1c2一定量的某一溶质在一定量的溶剂系统中分配时，转移次数越多，即分溶管数越多，其分溶曲线越集中，即峰形越窄而高，这样有利于混合物中各物质的完全分离。D=1的物质的洗脱图谱和平衡次数的关系。在柱上的相对分布---+++二、离子交换层析(IEX)（一）基本原理+++---++++++---++++++------------+++

8、+++------支持物和带电配体带电样品分子平衡离子阳离子交换剂：解离基团带负电，能结合阳离子。阴离子交换剂：解离基团带正电，能结合阴离子。当pH﹥pI时，分子带