《质粒与载体》PPT课件

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1、第三章质粒与载体1.质粒概述质粒（plasmid）：一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。1.1质粒的分子结构通常以共价闭合环状的超螺旋双链DNA分子存在于细胞中；也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒；疏螺旋体、链霉菌和酵母菌1.2质粒的检测提取所有胞内DNA后电镜观察；超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；通常用碱裂解法提取质粒1.3质粒的命名第1个字母(小写)：p，质粒（plasmid）;第2，3个字母（大写）：人名，实验室名，表型性状或其他特征的英文缩写;编号（阿拉伯数字）：区别同一类型的不同质粒例：pUC18,pUC191.4质粒

2、的主要类型质粒与宿主的关系：质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长优势。质粒的主要类型（P202）质粒所编码的功能和赋予宿主的表型效应致育因子(Fertilityfactor，F因子)抗性因子(Resistancefactor，R因子)产细菌素的质粒（Bacteriocinproductionplasmid）毒性质粒(virulenceplasmid)代谢质粒(Metabolicplasmid)隐秘质粒(crypticplasmid)1.5质粒的一般特性非必要遗传物质一般控制次要性状，能自我复制并稳定遗

3、传。质粒的存在一般也有助于生物在特殊环境下的生长；在细胞内的大小和数量不相同一般大质粒（分子量>60M道尔顿）拷贝数少，小质粒（分子量<15M道尔顿）拷贝数较多。氯霉素等可抑制染色体DNA复制而使质粒拷贝数扩增；互不相容性属于同一组并具有共同阻遏物的质粒不能在同一细胞并存；具有可转移性及稳定性以较高频率（10-6），通过细胞间的接合作用或其它机制从供体转移至受体，在细胞分裂前复制，均等分配至子细胞中；可整合性在一定条件下，质粒可以整合到染色体DNA上，并可重新脱落下来可重组性不同质粒或质粒与染色体上的基因可以在细胞内或细胞外进行交换并形成新的重组质粒；可消除性经高温、吖啶橙

4、或丝裂霉素C等可以消除质粒，宿主细胞同时也失去质粒所携带的表型性状；耐碱性与染色体DNA相比，质粒有较高的耐碱性，调pH至12.4，可使染色体DNA变性，通过离心将其与质粒分离2.质粒的复制和调节2.1质粒的大小常见质粒大小的范围为1～200kb，个别大质粒可达800～1000kb质粒的大小常用分子量MD或碱基对数kb来表示。1MD的双链DNA≈1.65kb。未知质粒的大小通常可以在相同条件下与已知其大小的几个标准质粒比较并依其电泳距离作图来估算。最精确的测定需要对质粒DNA作序列分析，然后从所含碱基数目来直接推算出其大小和分子量。2.2质粒的拷贝数质粒的数量亦称为质粒在每一

5、细胞中存在的拷贝数(copynumber)不同质粒在细胞中的拷贝数各异。一般而言，质粒的拷贝数与其分子量成反比关系，分子量大的拷贝数低，分子量小的拷贝数高。如F因子这一类质粒，每个细胞中只有1～2个拷贝的质粒，它们的复制受到严格控制，称为严紧型质粒(stringentplasmids)或低拷贝质粒。分子量小的(如ColE1质粒)拷贝数高，每个细胞中有10～100个拷贝的质粒，说明它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒(relaxedplasmids)或高拷贝质粒。基因工程中为获得大量的基因产物所用的载体质粒便是这类松弛型质粒。2.3质粒复制的模型复制子(replicon)是

6、一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，每一个质粒也是一个复制子。复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子,至少需要有一个复制起点,即ori位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做oriV。质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型复制为主。在θ型复制中，有单向复制和双向复制两种类型，如R1、R100等的复制是单向的，而F和R6k是双向复制类型。质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质。而复制所需要的其它蛋白，如DNA聚合酶、连接酶、引物酶、连接酶、RNA-H酶、解旋酶(gyrase)和拓扑异构酶I、dnaB和dnaC基因

7、产物(沿链延伸的DNA合成酶)等都是利用寄主的复制酶体系。复制起点(ori)区的功能ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于它们的作用位点---ori序列附近将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入原核细胞后,该重组DNA具有自主复制能力。pBR322是最早人工构建的质粒载体。通过将下面几部分不同来源的DNA片段连接起来而构成的环状质粒：来源于ColE1的衍生质粒pMB1的DNA复制起点(ori)及rop区；来源于质粒pSC101的四环