《酶的固定化》课件

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1、Chapter5TheimmobileofEnzyme，CellandProtoplast酶、细胞、原生质体固定化游离酶的缺点酶的稳定性差，易受外界因素影响而失活酶不易回收利用（酶的一次性使用）产物不易分纯，且难连续化生产酶的催化效率不够高Contentsofchapter5概述第一节酶固定化第二节细胞固定化第三节原生质体固定化2.什么是固定化酶？水溶性酶水不溶性载体水溶性酶活化基团固定化酶酶的固定化固定化酶概念指固定在一定载体上并在一定的空间范围内进行催化反应的酶。通过吸附、偶联、交联、包埋等物理或化学的方法制备成的具有催化活性的水不溶性酶。2.固定化酶的制备方法吸附法离子键

2、结合法共价键结合法交联法凝胶包埋法半透膜包埋法固定化方法非共价结合法化学结合法包埋法热处理法吸附法1.吸附作用力2.固体吸附剂包括活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石3.优缺点（3）包埋法将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。只适合作用于小分子底物和产物的酶。凝胶包埋法（网格型）半透膜包埋法（微囊型）包埋法1）凝胶包埋法（网格型）将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称为凝胶包埋法。首先被采用的网格包埋法是：固定化胰蛋白酶木瓜蛋白酶－淀粉酶Enzyme+N,N-甲叉双丙稀酰胺,丙稀

3、酰胺引发剂－－inactiation2）半透膜包埋法（微囊型）将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方法。界面聚合法是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体而将酶包裹起来。（3）结合法1）共价结合法☆通过共价键将酶与载体结合的方法。①结合方法ⅰ.将载体有关基团活化，然后将酶有关基因发生偶联反应；②与载体共价结合的酶的功能基团ε-氨基，α-氨基，α,β或γ位的羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。③载体天然有机载体（多糖、蛋白质、细胞等）无机物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）④优缺点ⅰ.优点：酶与载体结合牢固，一般不会

4、因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。ⅱ.缺点：反应条件苛刻，操作条件复杂；酶蛋白高级结构变化，破坏活性中心，活力降低。⑤载体活化方法A．重氮法B．叠氮法C．烷基化反应法D．溴化氰法A．重氮法反应示意式NH2NaNO2/HClN2+Cl-酶-TyrN=NOHCH2酶重氮盐衍生物载体固定化酶A．重氮法将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应，生成重氮盐衍生物，使载体引进活泼的重氮基团。载体活化后，活泼的重氮基团可与酶分子中的酚基或咪唑基发生偶联反应而制得固定化酶。B.叠氮法反应示意式OCH2COOHOCH2COOCH2CH3OH/HClOCH2CONHNH2NH2NH2（肼）OCH2

5、CON3NaNO2/HClOCH2CONH-酶酶-NH2B.叠氮法对含有羧基的载体，与肼基作用生成含有酰肼基团的载体，再与亚硝酸活化，生成叠氮化合物。最后与酶偶联。C．烷基化反应法含羟基的载体可用三氯三嗪等多卤代物进行活化，形成含有卤素基团的活化载体。卤素基团可与酶分子上的氨基、巯基、羟基等发生烷基化反应，制备成固定化酶。OHO酶OD．溴化氰法本方法主要用溴化氰（CNBr）活化多糖类（含有羟基）物质（如纤维素、葡聚糖、琼脂糖等，其中以琼脂糖为载体的占多数<大孔网状结构>），生成亚氨基碳酸衍生物。D．溴化氰法亚氨基碳酸基团在微碱性条件下，可与酶分子上的氨基反应，制成固定化酶。D．溴

6、化氰法用溴化氰法活化琼脂糖制备得到的固定化酶目前使用很广，特别用作亲和层析，有着良好的性能。共价结合法中载体的活化方法重氮法叠氮法烷基化法溴化氰法——含有苯氨基（亚硝酸）——含有酰肼基/羧基（亚硝酸）——含有羟基（三氯三嗪等多卤代物）——含有羟基（溴化氰活化）2）交联法借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法称为交联法。也可用于含酶菌体或菌体碎片的固定化。常用试剂：戊二醛、异氰酸酯、N，N’乙烯马来亚胺、双重氮联苯胺等。应用最广泛的是戊二醛，它两个醛基都可以与酶或蛋白质的游离氨基形成席夫碱（shiff）。第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联

7、的固定化酶。（4）热处理法将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶稳定在菌体内，而制备得到固定化菌体。热处理法只适用于热稳定性较好的酶的固定化，在热处理时，要严格控制好加热温度和时间，以免引起酶的变性失活。步骤step总体积Volume(ml)总活力Totalactivity(u)总蛋白Totalprotein(mg)比活力Specificactivity(u/mg)纯化倍数Purification(fold)收率Yield(%)粗酶1040460070168.1乙醇沉淀90