蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示

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1、蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）图示蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot,WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。培养细胞总蛋白提取试剂提取蛋白哺乳动物组织总蛋白提取试剂BCA蛋白定量试剂盒细菌总蛋白提取试剂BCA蛋白定量试剂盒（增强型）细胞胞浆和胞核蛋白提取试剂考马斯亮蓝（Bradford）蛋白定量试剂盒蛋白定量细胞真核膜蛋白提取试剂盒细胞线粒体提取试剂盒SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2、5、6X)红细胞裂解

2、液SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（30%Acr-Bis快速沉淀和浓缩蛋白试剂盒上样、电泳(29:1)、TEMED、10%SDS、1MTris-HCl,pH6.8、1.5MTris-HCl,pH8.8）SDS-PAGE电泳缓冲液（甘氨酸、Tris-Base、SDS）彩色预染蛋白分子量标准考马斯亮蓝染色硝酸纤维素（NC）膜、PVDF膜转膜试剂盒(常规法)染胶转膜缓冲液（甘氨酸、Tris-Base、甲醇）快速银染试剂盒转印滤纸丽春红染色液染膜封闭Western封闭液Western洗涤液（TBST）DAB显色试剂DAB显色检测试剂盒化学显色方法检测孵育一抗Western一抗

3、二抗稀BCIP/NBT显色试剂释液TBST洗膜TBST洗膜超敏化学发光ECL底物孵育二抗羊抗小鼠IgG-HRP超敏化学发光ECM试剂盒羊抗兔IgG-HRP显影定影试剂盒化学发光方法检测柯达X-OMATBT胶压片暗盒X光片背景去除液试剂盒蛋白印迹膜再生液(1)主要设备：1）超声细胞破碎仪2）Bio-Rad垂直电泳仪及转移系统3)Bio-RadChemiDoc™XRS+化学发光成像系统4）酶标仪（BCA法，具562nm波长）5）高速冷冻离心机(2)主要试剂：1）RIPA等裂解液2）2×或5×或6×或10×蛋白上样缓冲液3）彩色预染蛋白质分子量标准4）四甲基乙二胺（tet

4、ramethylethylenediamine,TEMED）5）10%过硫酸铵（ammomiumpersulfate,APS）6）TrisCl,1.5M(PH8.8)缓冲液7）TrisCl,1M(PH6.8)缓冲液8）30%Acr-Bis(29:1)(即30%acrylamide-bisacrylamide)9）甘氨酸（Glycine）10）Tris碱（Trisbase）11）十二烷基硫酸钠（SDS）12）甲醇（methanol）13）吐温-20（Tween-20）14）牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉15）PVDF膜16）ECL显色底物A液和B液（3）抗体1）β-

5、Actin等内参抗体2）辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG等带HRP的二抗3）指标抗体(4)耗材10、100、1000uL枪头与移液枪、EP管、EP管防爆夹、96孔板、单格或5格孵育盒、镊子、锡纸、保鲜膜、滤纸、乳胶手套、薄膜手套、医用口罩等A蛋白样本提取制备A-1细胞或组织裂解A-2蛋白定量A-3电泳上样样品的准备一般的抗体只能识别抗原蛋白中的部份序列结构（表位），因此，为使抗体能够达到结合该表位而需要将蛋白样本进行变性，使之打开折叠的空间结构，蛋白变性一般使用含阳离子变性去污剂如SDS的上样buffer（loadingbuffe

6、r），并于95-100°C煮沸5分钟。SDS的阴离子环绕蛋白肽键使之带负电荷，蛋白分子量不同，结合的SDS数量不同，所带负电荷也不同，电泳迁移速度不同，因此SDS-PAGE电泳可将不同分子量的蛋白分离开B电泳B-1PAGE胶的制备聚丙酰胺凝胶PAGE电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE胶是由两种化合物聚合而成的，即丙烯酰胺（acr）和N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及DMAP或TEMED，凝胶为中性、水溶性、三维网状结构。不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高浓度胶分离。B-2蛋白分子量

7、Marker预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪B-3阳性对照目的蛋白或明确表达目的蛋白的组织或细胞的蛋白提取物，用于检验整个实验体系和过程的正确性有效性，特别是一抗的质量和效率。建议使用该对照。可查阅文献或抗体说明书选择购买或自提该对照样本。B-4内参对照管家基因编码的、很多组织和细胞中都稳定表达的蛋白，用于检测整个WB实验过程及体系是否正常工作，并作为半定量检测目的蛋白表达量的标准对照。必须设立。B-5上样与电泳每孔上样量为20-40μg蛋白，使用10微升枪头或注射针头，勿溢出加样孔C转膜与显色（WesternBlot）C-1胶中蛋白