凝胶过滤层析法纯化牡蛎碱性磷酸酶

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1、实验十凝胶过滤柱层析纯化碱性磷酸酶一、目的要求1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。2.通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行纯化色谱的历史知识层析色谱Chromatography茨维特（MikhailTswett，俄国植物学家），1901年，植物色素分离1952年，James和Martin发明了气相色谱，获得1952年的诺贝尔化学奖用于生物分子分离分析的色谱技术液相色谱（常压液相色谱、高压液相色谱-HPLC）、吸附色谱（柱色谱、薄层色谱）、离子交换色谱、亲和色谱、金属螯合色谱（“镍柱”）、排阻色谱（凝胶色谱）二、原理凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构

2、的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。优点：a.条件温和b.操作简便c.损失少回收率高d.层析柱可反复使用凝胶的类型：Sephadex:交联葡聚糖Sepharose：琼脂糖凝胶Bio-GelABio-GelP：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000

3、005000-500000凝胶及柱的选择凝胶的处理及装柱凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡装柱时要注意操作压。装柱的两种方法：a.手工操作1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶b.电动搅拌下的装柱法（如图4-9）样品上柱分析用量：柱床体积的1—2%制备用量：柱床体积的10—20%洗脱收集部分收集器、核酸蛋白检测仪凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰四、操作方法（一）凝胶的选择与处理1.凝胶及柱的选择选择SephadexG50和1.5cm×60cm的柱子。2.凝胶的处理凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于

4、5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。（二）装柱1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。（三）凝胶柱的平衡通过2-3倍柱床容积的洗

5、脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。实验步骤1、按图示排列将凝胶柱及各仪器连接好。（1）凝胶柱的出水口与紫外检测仪的进水口（打“”符号者）连接，通过软管将紫外检测仪的出水口（打“⊙”符号者）与部分收集器连接；（2）用红、黑两条连接线将紫外检测仪与记录仪相连接—“红接红”、“黑接黑”；2、依次打开紫外检测仪、部分收集器、记录仪开关，对仪器进行预热。3、通过“量程/零位”切换开关，设定记录仪的量程为“10mv”，取下记录笔的笔套，检查记录笔是否可书写。4、转动紫外检测仪右侧板上的波长旋钮，设定检测波长为280

6、nm。5、打开凝胶柱出水口的夹子，使洗脱缓冲液流经检测器。把“灵敏度”旋钮选择到“100%”档，调节“光量”旋钮，使检测仪窗口数字显示为100，即透光率为100%。再将“灵敏度”开关转到“0.5A”档，缓慢调节“调零”旋钮，检测仪数字显示为“0”，并使记录仪指针在“0”位。以上步骤需反复调节几次，待层析系统平衡后，即可加样检测。（注意：在样品检测的过程中，不可再调节“调零”、“光量”旋钮！）6、完成以上步骤后，进行流速检测，记下凝胶柱中洗脱液流出2ml所需的时间，并以此时间对部分收集器进行定时。7、部分收集器的使用：（1）按下“手动/自动”键，使收集器处于“手动”状态，在此状态下设

7、置定时时间；（2）按“选择”键，每按一次移动一位，根据第6步的结果设定定时时间。当数字闪烁时，可通过“置数”键设置该位的时间，时间设定后再按一次选择键，即完成定时时间的设定。（注意：定时的时间单位为分钟，即本型号仪器的最小定时时间为1分钟）8、加样检测（1）打开驻上端的螺丝帽塞子，用滴管吸出层析住中多余的溶液直至液面与胶面相切。（2）沿着柱管壁将1ml碱性磷酸酶样品小心加入到凝胶床面上（注意不可将凝胶胶面冲起），打开出水口夹子，使样品溶液进入胶面内，直同时收集流出液，