南农生物分离工程修改生物分离6凝胶

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1、第六章凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则分子筛色谱（凝胶过滤）Gelfiltrationchromatography层析法所用的凝胶颗粒大小要均一，颗粒內外贯穿许多小孔径的通路，分子量小的物质，比较容易进入颗粒中，因此被延滞流出。对凝胶过滤介质的要求①亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用；②稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长，③具有一定的孔径分布范围；④机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。凝胶特性参数内水体积Vi：孔体积

2、外水体积Vo：颗粒间体积柱床体积VtVt=Vo+Vi+VgVt′=Vi+Vo洗脱体积VeVe=Vo+KdViKd=(Ve-Vo)/ViA：“全排阻”，流经体积VoKd=0C：“全渗入”，流经体积Vo+ViKd=1B：“部分排阻”或Ve=Vo+KdVi0＜Kd＜1Kd=(Ve-Vo)/Vi“排阻系数”或“分配系数”一定规格凝胶，Kd特征常数Kd＞1物质分子与凝胶之间有吸附Tyr=1.4G-25小分子Kd＜1水合作用NaCl0.8G0.9整个凝胶作为固定相Vi+VgKav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)=KdVi/(Vt-Vo)有效分配

3、系数分子形状不同M相近也可分开牛血清白蛋白（球）、兔血红蛋白（棍）68000d凝胶特性参数①排阻极限（exclusionlimit）是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如SephadexG50的排阻极限是30kD。②分级范围（fractionationrange）能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。SephadexG50的分级范围为1.5～30kD。③凝胶粒径凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50～150

4、µm（100～200目），例如，Sepharose和Sephadex凝胶粒径分布为45～165µm。硬凝胶粒径较小，一般为5～50µm。⑤床体积（bedvolume）即1g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。SephadexG50的床体积为9～11cm3/g干胶。⑥空隙体积（voidvolume）即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000kD的水溶性蓝色葡聚糖（bluedextran）。对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等

5、，可参考使用。GFC的优点①溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收率可接近100％；②每批分离操作结束后不需要进行介质的再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度；③作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高；④分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。GFC的不足之处①仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，分离较慢、需严格控制流速；②经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作（如超滤、离子交换和亲和色谱等）后使用。凝胶的结构和性

6、质葡聚糖系其中SephadexG是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。SephadexG是利用葡聚糖（右旋糖酐）交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。Sephadex凝胶按交联度大小，分G10～G200共八种型号。G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D<700<1500<50001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000性质对稀酸、

7、稀碱、盐溶液稳定湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温交联度↓稳定性↓凝胶含少量羧基，对阳离子轻微吸附，操作时使I＞0.02mol/l芳香族、杂环化合物有时Kd＞1新凝胶柱非特异性吸附蛋白，先用廉价较惰性蛋白饱和吸附、洗涤规格编号间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限G-50分离限1500-30000G-150：5000-400000对蛋白、多糖分离范围不同（多糖分子体积比相同M的蛋白大）粒度：直径100-300um粗粒20-80um细粒40-120um中粒保存湿法：悬浮于水、缓冲液中，0.02%NaN3，0-5℃干法：乙

8、醇分步处理（20%，40%，60%，80%）脱水收缩，抽滤，60-80℃吹干，室温半缩法：60-70%乙醇悬液，封口，4℃修饰葡聚糖凝胶亲脂性引入有机基团SephadexLH-20（羟丙基）（原SephadexG-25）流动相既可使用