多聚酶链式反应扩增DNA

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1、DNA多聚酶链式反应扩增DNA片断课题21、多聚酶链式反应的概念一、课题背景2、多聚酶链式反应的应用：的诊断、、、和DNA等各方面。遗传疾病刑侦破案古生物学基因克隆序列测定1、DNA分子的组成成分和结构DNA分子的基本组成单位是.共有种,每个基本单位是由一分子的、一分子的、和一分子的构成。脱氧核甘酸4磷酸碱基脱氧核糖那么DNA分子的平面结构怎样呢？二、基础知识2、DNA分子复制的过程参与的组分在DNA复制中的作用解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料DNA聚合酶催化合成DNA子链

2、引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸解旋酶DNA母链4种脱氧核苷酸DNA聚合酶引物（RNA）打开DNA双链模板合成子链原料催化子链合成使DNA聚合酶能从引物3′端开始连接脱氧核苷酸思考：3、体内DNA复制的条件是什么？体外扩增DNA如何提供相似环境？变性（80-100℃）Taq聚合酶（耐高温）20—30个核苷酸构成DNA或RNADNA双链单链变性（加热80-100℃）复性（缓慢冷却）4、DNA分子的热变性原理：变性的目的：复性的目的：解开双链有利于引物Ⅰ和引物Ⅱ与两条单链的结合（一）、PCR技术的原理

3、利用DNA分子的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，从而完成体外DAN分子的扩增。体外DNA复制的条件：四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、引物、模板；缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。复制的方向：子链的5′端向3′端延伸。（一）、PCR技术原理PCR参与的组分在DNA复制中的作用高温变性解旋酶打开DNA双链DNA母链提供DNA复制的模板4种脱氧核苷酸合成子链的原料Taq酶（耐高温）DNA聚合酶催化合成DNA子链20-30个核苷酸构成DNA或RNA单链引物使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸（二）

4、、PCR的反应过程每个循环包括：变性——复性——延伸从第二轮循环开始，上一次循环的产物也可以作为模板参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。DNA双链反向平行3′5′5′3′1、DNA分子的3′端与5′端-OH端为3′;磷酸基团的末端为5′。2、DNA分子由两条反向平行的脱氧核苷酸链根据碱基互补配对原则形成氢键连接而成。基本单位ATGCATGC3′3′5′5′实验操作步骤：（准备）按配方将

5、所需试剂摆放在实验桌上（移液）用微量移液器按配方在微量离心管中依次加入各组分（混合）盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁（离心）将微量离心管放在离心机上（反应）将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序反应周期高温变性低温复性(退火)适温延伸反应循环数：扩增倍数：109以上30多次以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率（二）、PCR的反应过程1、循环之前的一次预变性2、PCR一般要经历三十多次循环5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/A—G引物Ⅰ5/3/G—G引物Ⅱ变性复性延伸复制过程5/3/G—GT

6、—C5/3/G—GT—C5/3/G—A引物Ⅰ5/3/G—A引物Ⅰ5/3/G—G引物Ⅱ5/3/G—A引物Ⅰ3/3/5/G—AC—C3/5/G—AC—C5/3/G—G引物Ⅱ5/3/G—G引物Ⅱ5/3/G—G引物Ⅱ3/5/3/G—A引物Ⅰ（1）变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链。（2）复性：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。（3）延伸：温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。（二）、PCR的

7、反应过程3、每个循环包括：变性——复性——延伸（1）PCR循环--变性95℃变性（1）PCR循环--变性95℃变性（1）PCR循环--变性95℃变性（2）PCR循环—复性55℃复性（3）PCR循环—延伸（3）PCR循环—延伸（3）PCR循环—延伸（3）PCR循环—延伸4、循环特点：①上一次循环的产物为下一循环的模板②结果单链中有最初母链的只两条（无引物存在于两个子代DNA分子中③其它子代DNA分子都为双引物分子式④处于两引物之间的DNA序列呈指数增长1×2N①②三、实验步骤：准备好PCR反应体系的配方用微量移液器按配方

8、在往微量离心管中加入各组分盖严盖子，用手指轻轻弹击管壁混合反应液离心10S将离心管放入PCR仪上，设置好循环程序进行反应四、操作提示：操作提示1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。2．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂