酿酒酵母木糖代谢工程中辅酶

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1、酿酒酵母木糖代谢工程中辅酶工程的研究进展*摘要辅酶工程（cofactorengineering）是代谢工程的一个重要分支，它通过改变辅酶的再生途径，达到改变细胞内代谢产物构成的目的。介绍了酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)木糖代谢工程中，利用辅酶工程解决氧化还原平衡问题的研究进展，包括引入转氢酶系统，增加代谢中可利用的NADPH，实现NADH的厌氧氧化等策略。同时介绍了改变XR、XDH辅酶偏好的研究进展。关键词:辅酶工程木糖酒精酿酒酵母氧化还原辅酶工程（cofactore

2、ngineering），是代谢工程的一个重要分支。利用分子生物学技术，改造细胞内代谢途径，实现细胞内辅酶的再生［1］，改变辅酶氧化还原态的比率，从而改变细胞的代谢功能及氧化还原酶催化的产物构成。随着代谢工程的广泛应用，代谢流改造过程中目标产物得率不高，副产物积累的问题日趋显现，其产生的原因之一就是代谢网络的辅酶氧化还原的不平衡，为此在代谢工程研究过程中，必须对微生物代谢网络结构和功能进行准确分析，在改变代谢途径的同时，要考虑整个代谢过程的平衡，尤其是辅酶的平衡。根据代谢工程（MetabolicE

3、ngineering）原理，利用分子生物学技术，拓展传统乙醇生产菌酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的发酵底物，以最终实现木质纤维原料发酵生产酒精，是随着燃料乙醇广泛推广应用，而备受关注的问题之一。木糖是木质纤维水解液中含量仅次于葡萄糖的单糖。酿酒酵母由于缺乏转化木糖为木酮糖的酶系，不能利用木糖，但能利用其异构体木酮糖。木糖异构酶（xyloseisomerase,XI）可以催化木糖形成木酮糖，目前只有来源于嗜热古菌Thermusthermophilus［2］及低等真菌Pi

4、romycessp［3］的木糖异构酶基因xylA在酿酒酵母中得到了活性表达。多年来，在酿酒酵母中建立木糖向木酮糖转化途径的工作，主要是通过引入树干毕赤氏酵母（Pichiastipitis）的木糖还原酶(xylosereductase,XR)和木糖醇脱氢酶(xylitoldehydrogenase,XDH)基因XYL1和XYL2来实现的［4］。虽然代谢工程菌株有较高的木糖利用率，但在发酵过程中，中间产物木糖醇积累［4］，代谢流不能很好地向下进行，已成为酿酒酵母木糖代谢工程菌生产乙醇的瓶颈问题。其主

5、要原因是XR和XDH的辅酶分别倾向于NADPH和NAD+（图1），一方面这两个辅酶在酿酒酵母中不能直接转化，其再生过程彼此独立，造成了细胞内辅酶氧化还原的不平衡，另一方面，在乙醇发酵的氧限制条件下，酵母细胞内NADH积累，不能及时还原成XDH所需的辅酶NAD+，使得中间产物木糖醇积累，影响乙醇得率的提高。利用辅酶工程手段，改变细胞内辅酶的比率，实现辅酶的再生，是解决这一问题的有效措施之一。1辅酶在酵母中的作用及转化形式烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）是代谢

6、中的重要辅酶，酿酒酵母中由于缺乏转氢酶，二者的代谢是不相偶联的，作用也不同，NADH主要用于分解代谢，而NADPH则主要参与合成代谢。图1真菌木糖代谢流程图Fig.1Xylosemetabolicpathwayinfungi在酿酒酵母中，糖分解及代谢产物生产过程产生大量NADH。为了维持细胞正常生长和代谢流顺利进行，NADH氧化还原必须保持平衡。在好氧生长条件下，酵母中NADH的氧化可以通过线粒体膜上的电子传递链实现；而在氧缺乏条件下，NADH不能通过线粒体电子传递链被氧化，NAD+再生受阻，细

7、胞需通过糖酵解过程中的产物如磷酸二羟丙酮作为内源电子受体再生细胞质中的NAD+，从而造成甘油等代谢产物的积累。在引入XR、XDH途径的重组酿酒酵母工程菌，在限氧条件下NADH积累导致木糖醇的大量产生。NADPH是还原力的主要来源，在酿酒酵母中，NADPH产生主要来源于磷酸戊糖途径，而消耗主要用于合成代谢，包括脂类的合成，氨基酸、核酸的合成等。2辅酶工程在重组酿酒酵母木糖代谢途径中的应用为了有效生产酒精，并减少木糖醇等副产物积累，酿酒酵母木糖代谢工程的一个重要方面就是解决辅酶的氧化还原平衡问题。目

8、前，已有利用辅酶工程在大肠杆菌（Escherichiacoli）［5~7］和乳酸菌（Lactococcuslactis）［8］细胞内改造NADH氧化还原状态的成功报道。对于酿酒酵母辅酶代谢的改造，国外也已有相关尝试和研究，有的已经取得了比较良好的效果，主要集中在以下几个方面。2.1引入转氢酶2.1.1引入外源转氢酶转氢酶（Transhydrogenase）是一种直接催化两种辅酶之间可逆转换的酶［9］（图2）。它有两种存在形式，一种是膜定位嘧啶核苷酸转氢酶，通常催化图2中<1>的反应方向，同时消耗