土壤细菌的分离及纯化

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1、实验二土壤微生物的分离纯化与鉴定一、目的要求1.通过从土壤中分离纯化细菌，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。2.掌握微生物的鉴定技术第一部分培养基的配制与灭菌一、实验目的1.学习配制培养基的原理，并掌握配制培养基的一般方法和步骤。2.学习几种常用培养基的配制、分装和灭菌的操作方法.3.进一步熟练掌握高压蒸汽灭菌锅的使用方法。二、实验原理（1）培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。在自然界中，微生物种类繁多，营养类型

2、多样，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多。但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素等。不同微生物对pH要求不一样，霉菌和酵母的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的(嗜碱细菌和嗜酸细菌例外)。所以配制培养基时，都要根据不同微生物的要求将培养基的pH调到合适的范围。此外，由于配制培养的各类营养物质和容器等含有各种微生物，因此，已配制好的培养基必须立即灭菌，如果来不及灭菌，应暂存冰箱内，以防止其中的微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养的酸碱

3、度所带来不利的影响。二、实验原理（2）根据微生物的种类和实验目的不同，培养基的类别如下：按成分的不同：天然培养基、合成培养基和半合成培养基。按培养基的物理状态分：固体培养基、半固体培养基和液体培养基。按培养基的用途分：基础培养基、营养培养基（加富培养基）、鉴别培养基和选择培养基。二、实验原理（3）目前已有各种商品化的“干燥培养基”成品出售。这种培养基是将新鲜配制的液体培养基用喷雾干燥法、真空干燥法、低温干燥法或蒸发干燥法等将培养基内所含的水分去掉；或将培养基内的各种固形成分，经适当处理、充分混匀，便成干燥粉末而成。使用

4、时只要按比例加入一定量的水，经溶解、分装，高压蒸气灭菌，即可使用。这种培养基的优点是配制省时，携带方便，使用简易，质量稳定。三、实验器材1.药品及试剂：根据所要制备的培养基准备所需试剂。2.仪器及其它：试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(5.5-9.0)、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、pH试纸等四、实验步骤——培养基的制备与分装1.称量：按培养基配方比例依次准确地称取药品。2.熔化：在沸水浴锅中或电炉上加热熔化。3.调pH：用1mol

5、/LNaOH或1mol/LHCl调pH至培养基所需pH。4.过滤：趁热用多层纱布过滤（根据实际情况确定是否过滤）5.分装：将溶化的固体培养基趁热加至漏斗上，装试管时，注意管口不要沾上培养基。液体分装装量不超过试管的1/4，固体分装装量不超过试管的1/5，分装三角瓶的量不超过三角瓶容积的一半，半固体分装装量为试管的1/3，灭菌后垂直待凝。6.加棉塞：培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能，然后包扎一层牛皮纸。试管应先捆成一捆后再于棉塞外包扎牛皮纸，贴上

6、标签，注明培养基名称、日期、组别。四、实验步骤——无菌水的制备1.用量筒量取90ml水于带玻璃珠三角瓶中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。2.用10ml吸管取9ml水于试管中，塞上棉塞，包扎牛皮纸。四、实验步骤——器皿的准备1.培养皿的包装：每10套一包，用旧报纸或牛皮纸包扎（或放在特制铁皮圆筒里，加盖扣严）。2.吸管的包装：首先在吸管的上端塞上一小段棉花，用长纸条包扎、打结。3.玻璃涂布棒的包装：方法同吸管的包装。4.枪尖的包装：放入枪尖盒，牛皮纸包装。四、实验步骤——高压灭菌1.将所要灭菌物品放入高压蒸汽灭菌锅内，根据需要设

7、定灭菌温度和时间（一般121℃，20min灭菌，若培养基中含有葡萄糖等成分时，113℃，30min灭菌）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。2.灭菌完毕，将试管培养基搁成斜面，搁置的斜面长度以不超过试管总长度的一半为宜。培养基冷至50℃左右，倒平板。3.将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24～48h，以检查灭菌是否彻底。五、思考题1.培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养菌是无菌的？2.加压蒸汽灭菌的原理是什么？是否只要压力表上的指针指到所需的压力时就能达到所需灭菌温度？为什么？第二部分微

8、生物的分离与纯化一、目的要求1.通过从土壤中分离纯化细菌，掌握微生物的分离纯化方法和无菌操作技术。2.初步掌握微生物的菌种保藏技术。二、实验原理（1）自然界中各种微生物混杂生活在一起，要研究某种微生物的特性，首先须使该微生物处于纯培养状态。从混杂的微生物群体中获得只含有某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的大