蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用

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1、第11章蛋白质组学及其在微生物学研究中的应用第一节引言第二节蛋白质组学研究基本技术第三节微生物蛋白质组学主要内容第一节引言背景基因组时代→后基因组时代核苷酸序列本身很难直接与生命功能和生命现象挂起钩，而蛋白质才是生物功能的最终执行者。蛋白质数目大大超过基因数目。蛋白质随时间和空间而变化。mRNA水平的基因表达研究取得进展，但mRNA与蛋白质间的相关系数仅为0.4～0.5蛋白质自身特点难以从DNA和mRNA水平得到解答蛋白质组学的概念蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，被定义为：一个基因组/一种生物或

2、一种细胞/组织所表达的全部蛋白质。对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。在空间和时间上动态变化着的整体。蛋白质组是：蛋白质组学(proteomics)指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。蛋白质组学研究的内容蛋白质表达模式(或蛋白质组组成)的研究蛋白质组组成的分析鉴定是蛋白质组学中的与基因组学相对应的主要内容。它要

3、求对蛋白质组进行表征,即实现所有蛋白质的分离、鉴定及其图谱化。双向凝胶电泳(2-DＥ)和质谱(Massspectrometry)技术是当前分离鉴定蛋白质的两大支柱技术蛋白质组功能模式(目前主要集中在蛋白质相互作用网络关系)的研究大规模的蛋白质分析过程样品制备是蛋白质组研究的第一步也是最关键的一步。蛋白质分离（技术）：二维电泳（核心技术）、多维色谱蛋白质分析与鉴定（技术）：质谱技术（核心技术）、蛋白质芯片技术、酵母双杂交技术和噬菌体表面展示技术等。★蛋白质组发展的瓶颈是缺乏自动化的蛋白质分析的完整途径。第二节蛋白质组学研究基本技术典型的蛋白质

4、组学研究常分为四个步骤：从生物学物质（如细胞、组织、体液等）提取蛋白质混合液分离蛋白质混合液将有意义的蛋白质消化成肽进行质谱分析将质谱获得的数据利用各种生物信息学工具进行分析蛋白质组学发展依赖于高通量分离、鉴定和解析蛋白质技术的进步。重要技术突破主要包括三点：固相化PH梯度二维电泳（IPG-2-DE)的发明与完善；生物质谱，即应用软电离技术对生物大分子进行分析的质谱技术的发展；生物信息学发展。一、蛋白质组研究中的蛋白质分离（一）、二维（双向）凝胶电泳two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)：◆利用蛋白质的等电

5、点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。原理◆第一向在高压电场下对蛋白质进行等电聚焦电泳技术(IEF)将蛋白质混合物按照等电点高低进行分离,再在第一向垂直方向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照相对分子质量大小进行蛋白质分离。◆1975年首先由O’Farrell等创立。特点可分离10～100kD分子量的蛋白质高灵敏度和高分辨率便于计算机进行图像分析处理与质谱分析匹配第一向IEF电泳传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。pH凝胶制作的不稳定和重复性差限制了等点聚焦电泳技术的应用，Bjellgvist等

6、发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，GÖrg等成功地将之应用于双向电泳。优点固相pH梯度等电聚焦的优点◆克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。◆稳定的可以随意精确设定的pH梯度。尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。第二向SDS-PAGE电泳垂直板电泳水平超薄胶电泳双向电泳典型过程包括：①蛋白质样品制备：要防止蛋白质酶降解蛋白质。②上样一种是IPG胶条重泡胀衙利用加样杯边运行等点聚焦边上样。别一种是将样品与重泡胀液混合，在IPG胶条泡胀的同时样品出参入了胶条。③IPG的运行和平衡④SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳⑤胶上

7、蛋白质检测和定量：荧光染色灵敏度比考染高而与银染相仿，线性范围要远高地银染，与质谱兼容性好。⑥图像采集、分析及数据处理2-DE技术的缺点◆所能分离的蛋白质的性质有一定限制，如蛋白质分离范围一般为8~200kD，对极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，包含信号蛋白和转录因子的低丰度蛋白质难于有效分离。◆在2－D胶上有些蛋白质点量太少，难以进行质谱鉴定；操作费时、费力，自动化程度低难于与质谱联用实现自动化性质联用。2、新型非凝胶技术◆高效液相色谱法Highperformanceliquidchromatography，HPLC◆毛细管电泳capillar

8、yelectrophoresis，CE◆液相等点聚焦和毛细管色谱capillaryelectrochromatography★特点：自动化程度高、分辨率高，检测限低。采用凝胶技术