外源表达产物的分离纯化

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1、A重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则10外源基因表达产物的分离纯化针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶

2、处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型等电点处于极端区域（pI≤5或pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10-8-10-4mol/L）；疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负

3、荷量等参数方面显示出极大的优越性。多种分离纯化技术的联合运用在进行重组蛋白的纯化时，通常需要综合使用多种技术，一般来说，在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Seperose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉分离纯化过程的规模化蛋白

4、质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。B离子交换层析10外源基因表达产物的分离纯化离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则离子交换现象十八世纪中期由Thompson所发现，后来J.ThomasWay全面研究。1935年B.A.Adams和Holmes研究合成了具有离子交换功能的高分子材料，第一批离子交换树

5、脂。随后几年里又发展了多种类型离子交换树脂并在水处理方面得到应用。离子交换树脂的大发展主要是在二次世界大战以后。离子交换树脂的发展二战后美国和英国一些公司广泛进行了合成离子交换树脂的研究工作，G.F.达莱利奥成功地合成了聚苯乙烯系、聚丙烯酸系阳离子交换树脂，这时，离子交换树脂已经成为一类新型高分子材料，人们认识到，用它可以比较简单地达到离子性物质的分离、纯化和浓缩的目的，而不求助于结晶和消耗热能的蒸发工艺。离子交换树脂的发展六十年代、七十年代，离子交换树脂的发展又有了重要突破，新的聚合方法的发明和一些大公司的加盟如美国的(R

6、ohmandHass)和德国的(Bayer)等为离子交换树脂的广泛应用开辟了新的前景。离子交换长期以来应用于水处理和金属的回收。在生物工业中，主要应用在抗生素、氨基酸、有机酸等小分子的提取分离上。近年来在蛋白质等生物大分子的分离提取也有应用。1942年毕业于西南联合大学1952年获美国印第安纳大学博士学位南开大学教授1980年当选为中国科学院院士开创并发展了我国的离子交换树脂和吸附工业，发明了大孔离子交换树脂，系统研究了新型离子交换树脂和大孔新型吸附树脂的合成、结构、性质及应用。“离子交换树脂之父”何炳林离子交换层析的基本原

7、理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。离子交换介质的基本性质离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子交换剂的基本性能离子或阴离子起交换作用如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上，则在用洗脱液洗脱时，各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷

8、而解离下来不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的离子交换介质的基本性质阴离子交换剂：强碱型和弱碱型可电离的基团磺酸基（-SO3H）离子交换剂的分类磷酸基（-PO3H2）羧酸基（-COO