细胞生物学第三章细胞生物学研究方法

《细胞生物学第三章细胞生物学研究方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、第三章细胞生物学研究方法概论细胞形态结构的观察方法细胞组分的分析方法细胞培养、细胞工程与显微操作技术概论对实验技术的依赖性显微镜细胞学，奠基性作用电镜与生物化学及分子生物学结合细胞生物学，决定性作用BACK第一节细胞形态结构的观察方法光学显微镜技术(lightmicroscopy）0.2m电子显微镜技术(Electromicroscopy)0.2nm扫描探针显微镜(ScanningProbeMicroscope)3nm,0.7nm扫描遂道显微镜(scanningtunnelingmicr

2、oscope)（侧0.1-0.2，纵0.001nm）BACK光学显微镜技术普通复式光学显微镜技术荧光显微镜技术激光共焦点扫描显微镜技术相差和微分干涉显微镜技术BACK普通复式光学显微镜技术光镜样本制作显微镜组成光学放大系统照明系统机械和支架系统普通复式光学显微镜技术分辨率是指区分开两个质点间的最小距离当max=140°,min=450nm，空气N=1，D=292nm0.3m水N=1.33，D=219.6nm0.22m香柏油N=1.5，D=292nm0.2m(普通光镜最大分辨率,光

3、衍射限制)荧光显微镜技术(FluorescenceMicroscopy)原理与应用直接荧光标记技术间接免疫荧光标记技术在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位如绿色荧光蛋白(GFP)的应用荧光显微镜技术(FluorescenceMicroscopy)原理：以紫外线为光源，照射被检测物体发出荧光后，在显微镜下观察其形状及位置仪器自发荧光(叶绿素)、诱发荧光(酸性品红、甲基绿、吖啶橙)优点：多种成分定位只有激发荧光可成像，敏感度高染色简便标本呈彩色图像固定细胞和活细胞数字成像显微技术图像后期处理，

4、提高信/噪比、放大信号摄像机和计算机原理：摄取同一区域多幅图像，信号经计算机放大、假信号减弱或消除暗场显微技术明视野局限性具颜色，吸收或折射随机光暗场通过样品进入成像系统的仅折射光或衍射光微生物计数放射自显影的银颗粒观察分辨率低激光共焦扫描显微镜技术(LaserScanningConfocalMicroscopy)原理：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重构样品的三维结构激光共焦点扫描显微镜共焦点(物镜和聚光镜同时共聚焦)自动改变焦平面纵向分辨axialresolut

5、ion相差(phase-contrast)显微镜技术原理光线通过不同密度物质时，滞留程度不同，该显微镜将这种光程差或相位差转换成振幅差构造相差板，再次放大相位差，再经透镜聚集、叠加或抵消干涉，明暗区别明显优点活细胞，细胞核或线粒体动态微分干涉(differential-interference)显微镜技术原理平面偏振光经棱镜折射分成两束，不同时间经过样品的相邻部位，再经另一棱镜汇合，使样品厚度的微小差别转换成明暗区别优点增加样品反差和立体感可观察活细胞中较大细胞器与录象机连接，活细胞中颗粒及细胞器运

6、动用计算机辅助，更精细结构电子显微镜的基本知识电子显微镜与光学显微镜的基本区别电子显微镜的分辨率与有效放大倍数电子显微镜的基本构造主要电镜制样技术介绍超薄切片技术负染色技术冷冻断裂和冷冻蚀刻电镜技术电镜三维重构技术扫描电镜技术电子显微镜技术BACK电子显微镜与光学显微镜的基本区别光源:波长<0.1nm电子束棱镜：电磁透镜镜筒环境：高真空图象显示：荧光屏或感光胶片电子显微镜的分辨率与有效放大倍数人眼：0.2mm光镜：0.2m，放大1000倍电镜：0.2nm，放大1000000倍有效放大与无效放大电镜的

7、分辨率与分辨本领(处于最佳状态下的分辨率)，超薄切片的1/10电子显微镜的基本构造电子束照明系统电子枪、聚光镜成像系统物镜、中间镜与投影镜真空系统电子枪、镜筒及记录系统记录系统荧光屏、感光胶片电镜与光镜光路图比较电镜与光镜的比较显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可见光（400-700）紫外光（约200nm)电子束（0.01-0.9）玻璃透镜玻璃透镜电磁透镜不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用

8、样品对电子的散射和透射形成明暗反差超薄切片技术Ultrathinsection制样要求：样品很薄；完好保持其精细结构，40-50nm，即d为20m细胞可切几百片，需刚性、韧性固定：OsO4、戊二醛、KMnO4、高频微波(低温、快速、样块不宜太大)包埋：完整、耐干燥、电子轰击和真空挥发，环氧树脂(包埋剂要求)切片染色：锇酸染脂肪，铅盐染蛋白质，醋酸铀染核酸负