课哺乳动物总RNA提取及电泳

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1、第四课哺乳动物总RNA提取及RNA琼脂糖凝胶电泳第一部分哺乳动物总RNA提取实验原理异硫氰酸胍可将哺乳动物组织匀浆中蛋白质变性，十二烷基肌氨酸钠可使细胞裂解，并释放RNA，同时保持RAN的完整。苯酚也是蛋白质变性剂，加入氯仿后离心，溶液分为水相和有机相。酸性条件下DNA同蛋白质一起变性被离心下来，绝大部分RNA则保留于水相。水相的RNA可经异丙醇沉淀。实验试剂裂解液（4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠Ph7.0，0.1Mβ-巯基乙醇，0.5%十二烷基肌氨酸钠）2M醋酸纳，pH4.0水饱和苯酚，pH5.0氯仿75%乙醇（用DEPC处理的去离子水配置）DEPC处理的去离子水实验步骤取3

2、克组织，加30ml裂解液，匀浆。吸取500ul匀浆液于1.5ml微量离心管中.加50ul2M醋酸纳（pH4.0），500ul水饱和苯酚，100ul氯仿，震荡1分钟。冰上放置15分钟。13000rpm，4℃，5分钟。将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的苯酚/氯仿（1:1），震荡1分钟。13000rpm，4℃，5分钟。将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的氯仿，震荡1分钟。13000rpm，4℃，5分钟。将上清转移至1.5ml无酶微量离心管中，加等体积的异丙醇。0℃放置20分钟。13000rpm，4℃，10分钟。去上清。用1ml75%乙醇洗管壁。尽量去处乙醇

3、。室温干燥。将RNA沉淀溶于10ul经DEPC处理的去离子水中。-20℃保存。第二部分RNA琼脂糖凝胶电泳实验原理常用的变性剂甲醛或戊二醛可使蛋白质变性，也可破坏RNA分子的二、三级结构。因此在含有变性剂的琼脂糖凝胶中电泳，可防止RNA被降解，同时可以避免RNA高级结构对电泳结果的影响。实验试剂琼脂糖10XMOPS（吗啉代丙烷磺酸）(0.2MMOPS,50mMNaAc,10mMEDTA,Ph7.0)37%甲醛RNA上样缓冲液（50%甲酰胺，1XMOPS，6%甲醛，7%甘油，0.3%溴酚蓝）实验步骤称取0.5克琼脂糖，加40ml去离子水。加热将琼脂糖充分融解。当溶液温度降至60℃左

4、右，加5ml10XMOPS，5ml37%甲醛，2ulGoldView，混匀。倒入制胶板，室温静置至胶完全凝固。除去梳齿，将凝胶板放入电泳槽，加入1XMOPS至液面超过凝胶约2mm。取5ulRNA与10ulRNA上样缓冲液混匀。65℃10分钟，立即置冰上2分钟。上样，100V电泳40-50分钟。在紫外灯下观察电泳结果。思考题如何处理玻璃器皿及金属器械，使之无RNA酶？如何配制DEPC水？如何配制无RNA酶试剂？在提取RNA的实验中，你认为操作上应注意那些地方能有助于防止RNA降解？在提取RNA的实验中，你认为在哪些环节需要防止RNA酶污染？请预习下周实验《反转录合成cDNA第一链》