SOD、MDA、GSH

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1、改良的盐酸羟胺法测生物样品SOD活性一．SOD（T-SOD）活力测定：原理：羟胺在有氧环境下发生自氧化可产生超氧阴离子，产生的超氧阴离子可由NBT还原率而检测，在SOD存在下，超氧阴离子被分解，NBT还原被抑制。因此，用比色法测定NBT还原产物可以间接反映SOD的酶活力。仪器：可见光分光光度计试剂：75mMNa2CO3/NaHCO3缓冲液（pH=10.2，含0.15mMEDTA-Na2）5mMNH2OH·HCl0.3%（V/V）TritonX-1000.3ml0.98mMNBT0.1ml甲酸步骤：1.用1:5组织匀浆（血清可直接取样），3000rpm离心30mi

2、n，取上清20ul稀释至0.1ml2.按顺序加入如下试剂：75mMNa2CO3/NaHCO3缓冲液2.0ml5mMNH2OH·HCl0.5ml0.3%（V/V）TritonX-1000.3ml0.98mMNBT0.1ml3.立即计时，于37℃恒温水浴10min（避光）。4.2.0ml甲酸终止反应。5.E560nM比色，记录OD值。计算结果：酶单位表示：在本实验条件下，抑制率达50%所对应的提取液SOD含量即一个SOD单位（U）。可用每g蛋白（U/gprotein）表示。二．Mn-SOD活性测定：基于氰化物抑制CuZn-SOD非Mn-SOD活性的原理，在上述缓冲液

3、中加入KCN，使最终反应体系中的KCN浓度达到2mM，即将缓冲液配成含3mM的KCN。37℃孵育45分钟，以抑制CuZn-SOD。其余操作、步骤、计算方法同上。三．CuZn-SOD酶活力=T-SOD酶活力单位—Mn-SOD酶活力注意事项：1)对照组（非酶管）取样品同体积的三蒸水，其余步骤同样品。2)若测血中SOD，可取血清20ul，其余地操作步骤同上。来自：第四军医大学硕士王建宏学位论文《诊断剂量超声对鼠胚胎和人绒毛脂质过氧化及超微结构的影响》。导师：钱蕴秋。单位及专业：西京医院超声诊断科，超声诊断学。1991.5-1992.6。参考秦绪军、常耀明硕士论文原始参

4、考文献：1、KonoY.Generationofsuperoxideradicalduringautoxidationofhydroxylamineandanassayforsuperoxidedismutase.ArchBiochemBiophys.1978Feb;186(1):189-95.或者YasuhisaKono.Generationofsuperoxideradicalduringautoxidationofhydroxylamineandanassayforsuperoxidedismutase.AnchivesofBiochemistryandB

5、iophysics.1978Feb;186(1):189-95.2、Yisunetal.FreeRadResComms1988;4:299-309.刘树元制作2003-5-7荧光法测定血清脂质过氧化产物（MDA）原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（简称MDA），可与硫代巴比妥酸（简称TBA）缩合，形成红色产物。此红色物质在波长532nm有极大吸收峰，可用分光光度法进行定量测定。若以515nm为激发光，则在553nm有最强荧光强度，故可用荧光法进行微量测定。灵敏度高，再现性好，试样用量少，是该方法的优点。仪器：荧光分光光度计试剂：1)MDA标准储备液（1mmol/

6、L四乙氧基丙烷或四甲氧基丙烷水溶液）：准确称取22.03mg1，1，3，3-四乙氧基丙烷加水定容至100ml，放4℃冰箱，可保存三个月。2)MDA标准应用液（1μmol/L）：准确量取标准储备液0.1ml于100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，用时再准确稀释（现用现配）。3)1/24mol/LH2SO44)10%磷钨酸溶液5)0.67％硫代巴比妥酸（TBA）：新鲜配制（溶于水与冰醋酸等体积混合液）。6)正丁醇（水饱和）步骤：血清样品50μl1/24mol/LH2SO44.0ml10%磷钨酸500μl混匀放置5min2000rpm离心10分钟弃上清，空在滤纸上1/2

7、4mol/LH2SO42.0ml10%磷钨酸300μl混匀放置5min，2000rpm离心5分钟弃上清，空在滤纸上样品管空白管标准管双蒸水1.0ml(震1分钟)1.0ml/标准品//1/0.5/0.25/0.125/0.0625各1.0ml0.67％TBA1.0ml1.0ml1.0ml振荡、混匀100℃准确水浴1h取出流水冷却至室温正丁醇（水饱和）4.0ml振荡抽提1分钟，2000rpm离心5分钟取上清（正丁醇层）约3.0ml(若出现混浊，可加一滴无水乙醇)测定荧光强度，激发光（515nm）发射光（553nm）计算结果：丙二醛浓度=0.5×1.00/0.05×1

8、.05/0.5×f/F=